序論：寫作是一種深度的自我表達。它要求我們深入探索自己的思想和情感，挖掘那些隱藏在內心深處的真相，好投稿為您帶來了七篇基因工程疫苗范文，愿它們成為您寫作過程中的靈感催化劑，助力您的創作。

篇(1)

關鍵詞：植物疫苗；基因工程；表達系統；安全性

1 植物疫苗的免疫原理

植物疫苗可誘導粘膜免疫反應，小腸淋巴組織的粘膜上有一種特殊的細胞叫做膜細胞（M 細胞）。粘膜免疫應答就是由M 細胞識別抗原開始的。M細胞識別抗原并將其傳遞給巨噬細胞，巨噬細胞和其它抗原呈遞細胞，再將抗原展示給輔T細胞，輔T細胞識別外源蛋白質片段后就會刺激B細胞制造和釋放能中和抗原的抗體，當疾病因子出現時，記憶輔T細胞刺激胞毒T 細胞攻擊受感染的細胞，同時它迅速刺激記憶B 細胞分泌中和抗體消滅入侵的病原體。總的來說，轉基因植物疫苗可以誘導相應的血清型的IgA 和IgG 反應。

2 植物疫苗的特點

2.1 安全性高

植物是人類食物來源之一，除個別人群對某些特定的植物過敏外，其安全性高。用動物細胞生產疫苗，可能有動物病毒的污染，對人類存在潛在危害。而植物病毒不會感染人類，比較安全，同時也可避免微生物生產疫苗帶來的有害產物。

2.2 成本低

植物種植系統簡單易行，植物細胞培養條件簡單，便于進行遺傳操作，可通過大面積栽培獲得廉價的疫苗，且不需要技術、設備和種植條件等巨大投資。農作物可以當地生產，還易于儲藏和運輸，而且經過長期種植，植物栽培、收獲、貯藏、加工程序已經形成工業化。與植物生物反應器相比，原核生物反應器與動物生物反應器生產時需要昂貴的技術設備、大量的人力物力。

2.3 植物具有完整的真核表達系統

具有與動物相同的真核加工修飾系統。可以對重組蛋白進行糖基化、磷酸化、酰胺化、亞基正確裝配等。微生物系統不能對真核生物蛋白進行正確的翻譯后加工。

2.4 轉基因植物中的外源基因可重組

通過植物雜交的方法進行基因重組，進而在植物體內積累多種病原體的抗原基因，生產出方便高效的多聯疫苗。

3 植物基因工程疫苗外源基因的表達系統

3.1 瞬時表達系統

主要采用植物病毒作為載體，而外源基因插入到病毒基因組中，通過病毒感染植株，從而將外源基因導入植物細胞內，采用這種轉化方式，外源基因并不整合至植物基因組中，只是利用寄主細胞在細胞質中進行復制，以高拷貝的形式游離于植物中，并進行高效的表達，因此可在短時間內在植物細胞內積累大量的外源蛋白。采用農桿菌介導的轉化，外源基因蛋白的產量一般要低于細胞內可溶性蛋白總量的1%；而采用這種瞬時表達系統,外源基因蛋白總量會遠大于1%。

3.2 穩定整合系統

3.2.1 土壤農桿菌介導的遺傳轉化。目前根癌農桿菌主要用于雙子葉植物的遺傳轉化，其轉化植物的機制已從分子水平上基本得到解釋。而發根農桿菌，由于對Ri 質粒了解得還不充分，所以對這種轉化系統的研究主要集中在以生產次生代謝產物為目的的根組織培養和根的發育。采用農桿菌介導的植物轉化最常采用共培養法，即使用農桿菌菌液與葉盤、愈傷組織、懸浮培養細胞、莖段、下胚軸段、子葉切片等部分進行共培養，從而達到轉化的目的。

3.2.2 外源DNA 直接導入法。主要包括基因槍法、電激發、PEG誘導法、激光穿孔法、脂質體法、超聲波法，其中最常用的是基因槍法。它是將帶有外源基因的質粒用亞精胺包裹為直徑1μm 左右的金彈或鎢彈，再用高壓氦氣、火藥爆炸力、高壓放電氣體作為動力加速子彈，使它們穿過植物細胞壁和細胞膜，將外源基因帶入具有再生能力的植物組織，這樣可以在很大程度上縮短再生的時間，從而避免體細胞變異的發生。

4 以植物為載體的免疫技術

4.1 植物疫苗免疫原性和免疫保護作用

由于植物疫苗一般是通過食用來被人體利用。所以如何避免消化酶的影響來保護抗原就是一個重要的研究課題。目前，避免消化酶的影響來保護抗原可分為2類方法：①用沙門氏菌和弧狀霍亂桿菌作為載體；②用保護性的包被對抗原進行包裝。

用減毒的菌株可以把抗原引向粘膜的表面，有利于粘膜免疫系統攝取所表達的抗原。但是基于減毒菌株的方法具有潛在安全缺陷，而后者可通過生物降解的多聚物、脂質體、蛋白質體或者表達抗原的轉基因植物來實現。許多研究表明，植物材料可潛在地保護所選定的抗原。特別在種子中，植物可為亞單位疫苗提供一個富含蛋白酶抑制物的糖類聚合物基質環境。其它的抗原包裝方法需要煩瑣的處理步驟；而通過植物種子來進行生物包裝不需要任何額外的代價，就可以為這些抗原提供保護。在有關轉基因馬鈴薯的研究中，從輪狀病毒和產腸毒素大腸桿菌中所選的抗原分別與霍亂毒素的B和A2亞單位融合，抗原的免疫反應顯示出對Th1的偏愛性，并可誘導白細胞介素2和干擾素γ，CD4 + 水平也相應增加。Th1的偏愛性很可能是抗原或者載體的選擇結果。在佐劑的幫助下，亞單位疫苗的釋放能增加免疫反應量。霍亂毒素和大腸桿菌的熱不穩定毒素，它們與抗原共表達，有利于誘導保護性的免疫產生，改變口服免疫低效率遞呈。另外，有人證實了轉基因植物疫苗的粘膜傳輸中所誘發的免疫應答所具有的黏膜佐劑的特征，這給口服免疫可不需佐劑提供了依據，同時也提高了其安全性。

在以植物疫苗的口服免疫研究中，所候選的亞單位疫苗也具有較好的保護作用。馬鈴薯塊莖或谷物種子中表達的熱不穩定毒素的B 亞基和馬鈴薯中表達的霍亂毒素B 亞基用于小鼠口服免疫，可以保護老鼠免受痢疾的感染。另外，口服免疫由谷物種子表達的傳播性腸炎病毒的S2糖蛋白，對乳豬能夠起到很好的保護作用。目前，通過植物遞送系統來生產B 型肝炎的疫苗也逐漸成熟。

4.2 提高抗原在植物中的表達水平

利用植物進行疫苗開發，首要的問題是，植物能否表達相關的蛋白？目前為止，許多亞單位候選抗原在轉基因植物中成功表達，這些抗原主要包括感染人類、家畜、野生動物的細菌和病毒抗原。表達水平很大程度上取決于表達的蛋白和用于表達的植物種類，同時，構建的表達系統也影響抗原的表達水平，比如用于表達的細胞器基因組(核和質粒)、啟動子的強度和組織專一性、非翻譯前導序列和信號序列的選擇和表達蛋白的靶細胞器的定位等均對表達產生影響。一般而言，利用上述策略可以實現抗原高水平表達。然而，很難對表達系統進行比較，因為特定抗原對植物表達系統的選擇很重要，在不同的系統中其表達效果是不一樣的。近來，研究人員利用內質網滯留信號可提高外源基因的表達量，Mason等利用一個核表達系統，把蛋白定位于內質網滯留信號之后，熱不穩定毒素B亞單位在馬玲薯塊莖中表達量可達總可溶性蛋白質的0.2% ；在谷物種子中的表達量約占總可溶蛋白的4%或12% ，這些都依賴于所用的調節序列。另外，霍亂毒素（B）亞單位在利用內質網滯留信號時在煙草葉片中的表達量約占總可溶蛋白的4%。膜蛋白比可溶性蛋白更難于在轉基因植物中表達，大量研究表明，膜蛋白在植物中的表達量遠不及可溶性蛋白，這就需要優化表達系統以提高表達水平。

目前，轉基因馬玲薯表達B型肝炎的表面抗原水平已由馬玲薯大約1mg/g增加到馬玲薯大約16mg/g抗原，這樣可以大大減少口服劑量。目前許多研究表明，所欲表達的抗原在植物中能夠表達并裝配成四級結構。糖基化修飾的蛋白也可在植物中進行糖基化，盡管糖基化模式很可能存在著差別。在植物系統中表達的熱不穩定蛋白毒素的B亞單位和霍亂毒素的B亞單位，均有GM1受體結合活性，B型肝炎表面抗原和諾沃克病毒衣殼蛋白可形成類病毒顆粒，類病毒顆粒的形成，可認為有利于誘導免疫反應。

5 植物基因工程疫苗研究進展

5.1 反轉錄病毒載體

反轉錄病毒作為載體是在進行動物基因工程中發現的，許多研究人員認為它同樣適于植物基因工程，但目前研究的不多。

5.2 單鏈RNA植物病毒

單鏈RNA 植物病毒，即病毒RNA可直接作為mRNA的植物病毒，主要包括苜蓿花葉病毒(ALMV)、豇豆花葉病毒(CPMV)、雀麥花葉病毒(BMV)、煙草花葉病毒(TMV)等。它們作為外源基因載體主要通過以下步驟感染植物：病毒RNA 首先反轉錄為一條單鏈cDNA，在DNA聚合酶作用下形成雙鏈DNA，將其克隆入細菌質粒中，將外源基因插入質粒的cDNA中，最后通過體外轉錄，用帶有外源基因的RNA病毒感染植物，將其轉入植物細胞。

5.3單鏈DNA植物病毒載體

在單鏈DNA 植物病毒載體中，研究最多的是Geminiviruses(簡稱GeNV) ，又叫做雙粒病毒或雙聯體病毒。它一般含有2個成對并存的病毒顆粒，大小約為18～20nm，遺傳物質是單鏈DNA ,每2個顆粒中包含1～2個、2. 5～3.0 kb的環狀DNA分子。該病毒寄主廣泛，單子葉植物和雙子葉植物均可被感染，但感染部位僅限于植物的維管組織，且其傳播媒介主要是昆蟲，不能通過機械接種。

5.4 雙鏈DNA植物病毒載體

雙鏈DNA植物病毒載體中最典型的是花椰菜花葉病毒，它的基因組長約8kb，主要感染花椰菜、油菜、擬南芥等，主要寄主是蕓苔屬植物，目前尚未發現可感染豆科和單子葉植物。

6 植物疫苗的安全性

6.1 對環境的影響

由于在植物疫苗中包含了病原體的DN段，因而花粉和種子的散播造成的基因逃逸可能給人類帶來新的病原、毒素、過敏原等，因此對可能引起的基因漸滲現象必須做出充分的安全性評價,并規范植物疫苗的利用和管理，同時尋求技術方法。如可恢復阻塞(RBF)技術，它能使自然界中因漸滲而攜帶RBF 的雜種或近緣系植物死亡或不育或利用葉綠體轉化植物疫苗或培育植物疫苗的雄性不育系，這樣就可避免花粉傳播而帶來的潛在威脅，轉基因植物疫苗有著傳統疫苗無法比擬的優越性，已經成為一個研究熱點了。未來的研究應著眼于生產出作為醫藥商品的安全、可靠、有效的植物疫苗。轉基因植物疫苗應用最大的限制就是表達量低。現在的研究表明：可以通過葉綠體轉化、植物育種和利用食品加工技術來提高表達水平，而且研究還指出，運用攜帶蛋白和輔助蛋白可以增加抗原被免疫系統識別的能力。這些研究都使我們越來越接近生產出廉價“安全口服的商品植物疫苗”，這樣的疫苗將可以幫助人們預防疾病的傳播。

6.2對人類和動物的影響

抗生素抗性基因是篩選轉基因植物常用的標記基因。長期食用這類轉基因疫苗是否會對人體或動物造成抗生素醫療無效。轉基因植物中的新基因會不會傳遞給人畜腸道的正常微生物，引起菌群和數量的變化或插入并表達，從而危害人畜健康？這些問題目前都無法解答，仍需大量學者繼續研究論證。

7 展望

利用植物來表達和遞送疫苗技術的發展給免疫研究注入了新的內容。以往的研究中,在植物中表達了包括過濾性病毒、細菌、腸道和非腸道的病原體等各種不同的抗原，并做了相應免疫學研究。但植物疫苗面臨的最大問題是抗原蛋白在植物細胞表達量不高，低劑量抗原蛋白往往不能激發足夠的免疫反應，這不能僅靠增加植物組織攝取量得以解決，因為低劑量的重復免疫可能會導致機體的免疫耐受，導致機體對此抗原免疫反應保持“低調”，即使以后增加抗原蛋白的劑量也不能改變。另外，機體每天對植物組織的攝取量是一定的，不可能無限增加。因此，未來研究的重點之一是提高植物疫苗中抗原蛋白的表達量。隨著生物技術的發展和植物基因工程研究的深入，基于植物的疫苗遞送系統將更具吸引力，并呈現出廣闊的應用前景。

參考文獻

1 余祖華，王紅寧.用植物生物反應器研制基因工程疫苗的進展[J].生

物技術，2004（8）

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【關鍵詞】 藥學院；基因工程藥物；公選課；意義；存在問題；改進對策

基因工程是當前自然科學中最引人注目的前沿學科之一，自誕生以來以其旺盛的生命力獲得了迅猛的發展，不僅給生命科學帶來了許多令世人矚目的成績，并且在化學、藥學等諸多領域均有著引人注目的發展前景。自1982年美國Lilly公司推出重組胰島素以來，基因工程藥物的出現與發展不僅有效控制了多種威脅人類健康的重大疾病，而且極大擴展了疑難病癥的研究范圍，引起了現代醫藥行業的重大變革。因此，筆者于2007年起在學校開設《基因工程藥物》公選課，并對其教學內容和方法進行了一些思考和嘗試。

一、開設《基因工程藥物》公選課的意義

1、基因工程在藥學領域的應用必將在21世紀成為自然科學發展的核心之一

早在上個世紀日本學者伊東光就斷言：“21世紀是生命科學的世紀。”今天，這一預言已成為現實，人類生存與發展所面臨的許多重大問題都或多或少的與生命科學息息相關，這一點從近幾十年的許多諾貝爾獎得主的科研成果中也可以看出。而在生命科學中，基因工程是它的基礎核心學科。所以，未來的自然科學的發展必然需要與基因工程相結合。

從科學的發展來看，現代學科的發展已不再是傳統的單一學科的發展，而是通過多學科的交叉滲透研究促進所本學科的進步，過去單一學科研究的問題現在很多已經變成多學科共同關注的問題。由于基因工程對理工科各學科相關專業均可提供更廣闊的研究思路和重要的技術支持，因此基因工程現在已經成為各專業發展中重要的研究方法和手段。大學教育也應該適應這一發展趨勢，結合基因工程在藥學領域中的應用，開設《基因工程藥物》公選課能夠為理工科的學生打開一扇基因工程的窗戶，培養必要的學科交叉研究意識，為他們以后在本專業的發展上提供更廣闊的空間。

2、基因工程藥物對社會影響巨大，必須引起相關社會科學專業的重視

社會的發展與進步是全面的，不是單一的；社會科學和自然科學同樣也不是涇渭分明、互不侵犯，而是在不斷的發展中有相互融合的趨勢。作為一個自然科學家，必須要具備相當的社會科學常識，否則就有可能成為科學的狂人，社會的罪人，正如自然科學的發展促進了工業革命之后的社會進步，可是也造成了資源的浪費和環境的污染。同樣，作為一個社會科學研究者或從業人員必須要具備自然科學的常識，能夠在研究或管理中正確使用相關知識，對待相關問題，更好的為社會服務。

今天的時代是信息的時代，社會中充斥著各種各樣的信息，如何能夠在紛繁復雜的信息中尋找或利用相關資料，就必須了解相關的知識；今天的時代也是科技的時代，各種高科技成果在生活中的廣泛使用，使得我們必須在管理中要通曉相關的概念。基因工程藥物的發展和進步已經對社會造成了巨大影響，其產業化過程中的產品和概念也在社會中隨處可見，它促進了社會的進步，也潛藏著各種安全性和倫理學問題。例如“基因治療”使得科學家具有“扮演上帝”的可能性，將引起基因爭奪戰和基因殖民主義等一系列倫理學和法律問題……在未來，隨著基因工程藥物品種的不斷增加，如何能夠在為人類造福的同時盡量減少其對社會產生的負面影響，是社會科學必須考慮的問題。所以，社會科學專業本科生作為未來社會的管理者和研究者，有必要對他們進行基因工程藥物的啟蒙教育，這樣才能夠在未來讓基因工程藥物在社會上發揮更大的作用。

3、《基因工程藥物》公選課的開設對提高素質教育質量非常重要

由于我國在中等教育中采取了文理分科的方法，大多數高中在高一之后就開始文理分班，這使得本科生各專業之間有著極大的差別，理科生對于文科常識陌生，文科生對于理科知識不了解，這樣的培養方式非常不利于學生素質的提高。《基因工程藥物》作為前沿性學科對于科學的理論、方法論的傳播有著重要的意義，無論是哪個專業的學生，都可以通過這樣一門課較為系統的接受自然科學思想體系的訓練，可以很大程度的提高學生的創造力和思維的延展性，從而不僅能讓理科生拓寬個人的眼界，也能讓文科生學習使用理工科的思維方式，對于消除文理之間的鴻溝起到重要作用。同時，在本科生的培養中，我們一貫強調“寬口徑、厚基礎、全面發展”，只關注與本專業、本學科的成就與發展，只會讓學生的發展之路越走越窄，如果我們要培養具有創新精神、實踐能力的高素質人才，就不能閉門造車。

從另一方面來說，新世紀的競爭越來越激烈，大學生承受著來自社會、家庭、個人越來越大的壓力，在錯綜復雜的形勢面前，多一份知識的了解就會更有利于個人的進步和社會的發展。所以，《基因工程》公選課的開設對大學生素質教育的培養和提高非常重要。

二、《基因工程藥物》教學中存在的問題

1、對《基因工程藥物》學習意義認識不足

開設《基因工程藥物》公選課的目的在于拓寬知識面，提升專業素養，培養創新能力，提高綜合素質，但是對于學生而言，往往意識不到學習《基因工程藥物》的重要性。

首先，學生選課存在盲目性，導致學習缺乏針對性。通過和學生的交流筆者發現，一些學生選課的目的是出于對基因知識的好奇，而不是針對自身知識結構查漏補缺，提升自身能力，還有一些學生選《基因工程藥物》是受別人影響，他們也不知道學這門課有什么用，周圍的或同寢室的同學選了自己就選了。這就導致部分學生學習缺乏興趣，也不知道該怎么學、學什么。其次，學生對于公選課不重視，學習態度不端正，導致缺乏學習的主動性和自覺性。相當一部分學生對《基因工程藥物》公選課的學習無所謂，認為這又不是專業課，只是混個學分，即使上課，也沒打算好好學，沒有一個良好的心態，更沒有明確的學習規劃，這樣的學習效果可想而知。

2、學生來源復雜，程度參差不齊

和專業課不同，公選課的同學來自于不同院系不同專業，成分復雜。對于《基因工程藥物》這樣一門專業性很強的課程來說，專業的區別只是一個方面，更重要的是不同專業的學生對于課程的需求各有不同，給授課帶來一些困難。例如對于理工科相關專業的學生來說，他們的要求可能就要深入一些，相關的概念、理論理解起來也較為容易；但是對于一些文科學生而言，可能更希望獲得一些科普性質的知識，太過于專業會讓他們產生畏難心理，不利于進一步的學習。如何做到因材施教，是筆者在教學中始終面臨的問題。

三、《基因工程藥物》教學改進對策

1、端正認識，提高興趣

由于許多學生選《基因工程藥物》缺乏明顯的目的性，對上課當然就沒有興趣。所以，第一節課特別重要，不能使用過于專業的語言闡述基因工程藥物的相關概念和理論，這樣會讓學生畏懼。要從學習《基因工程藥物》的意義談起，例如重組生長激素和侏儒癥、如何正確對待流感疫苗等生活中、社會中常見的、有趣的案例入手，從科學的發展方向出發，使學生意識到學習這門課無論對現在的專業學習還是對未來的深造、就業都會產生難以估量的好處，不僅要讓學生在第一節課中產生對這門課的濃厚興趣，更要讓學生認識到通過學習可以給他們帶來實際的價值，從而增加他們學習的主動性和能動性。

當然，僅靠一節課遠遠不夠，要想每一節課都能留住學生的興趣，就要每一節課都能滿足他們的求知欲和好奇心，筆者在每一節課上都以實際發生的案例引入，盡量使用淺顯、通俗、易懂的語言講述相關的概念，重點放在概念和理論的引申上，因為公選課的學生都來自于不同專業，有文有理，不能像本專業的學生一樣講的深入，而是要在廣博上下功夫。例如從《逃離克隆島》片段引入，介紹克隆的相關知識和原理，最后 討論在倫理學、法 學、社會學等領域對“醫學克隆”的認識和爭論；結合“甲型H1N1流感”，從基因角度講述疫苗的研制、生產，說明基因工程藥物在實際生活中的巨大用處等。這樣做的優點是每一個專業的學生總能從課堂上找到和本專業相關的切入點，減少了距離感，增加了學生的興趣。

2、重在普及，強調重點

公選課的教學畢竟和專業課在授課對象上有較大差距，所以要有所區別，專業課的教學強調概念準確、原理清晰、深入透徹，要讓學生不僅“知其然”，還要“知其所以然”，要花很多時間在各種理論的說明和推導上。而公選課則不然，學生的目的各不相同，不同的需求會導致不同的學習行為，過于專業的講授可能會讓本專業的學生滿意，但可能會讓公選課的學生覺著索然無味。同時由于很多文科學生缺乏理工科的訓練，一些專業的知識會讓他們摸不著頭腦。因此，很多時候要把《基因工程藥物》公選課當做科普課上，做好自然科學的普及工作，給予學生一些課程的基礎訓練。

同時，對于一些理工科的學生也要滿足他們的求知欲，要在一些可能會引起他們興趣的要點上，用其他專業的方式或語言，如醫學、化學、環境工程等，較為深入的講述相關理論，這樣做既能引起他們興趣，又能讓他們更快、更深刻的理解概念。

3、加強交流，嘗試講座式教學

學生是我們服務的對象，了解他們的需求筆者認為是最重要的。所以課前課后，筆者總是早到晚走，在講臺下和學生溝通，了解他們的所思所想和感興趣的地方，按專業分成小組，指定組長，定期收集學生對授課內容的反饋，對授課過程中的問題第一時間解決，鼓勵學生提問題，授課內容也會針對學生的需求做適當調整。例如2008年北京奧運會期間，有學生無意中提出是否有“基因工程興奮劑”？筆者針對這一問題組織了促紅細胞生成素、生長激素等基因工程藥物的學習，并啟發學生進行基因工程藥物的倫理學討論，激發學生的學習興趣。

此外，傳統的教學方式容易引起學生的反感，讓他們覺著上課內容和他們無關，極易造成學生的課堂流失，而討論式、專題式的教學方式最能夠調到學生的學習的主動性和創造性。因此筆者采用講座式的授課方式，課程內容不依照教材章節，而是按學生需求分成不同內容的講座，課上加強互動，使學生不是被動的接受知識，而是成為課堂的主人。每一次課的最后都要留出一部分時間，鼓勵學生提問、討論和交流，讓他們主動思考，激發他們活躍的思維。例如“基因工程疫苗”一章，在最初兩年是以“乙肝疫苗”為例進行學習，但在2009年后就改為“甲型H1N1流感疫苗”，并結合“甲型H1N1流感疫苗”和“乙肝疫苗”兩者的對比，使學生正確對待疫苗的使用。

4、利用多媒體手段，加強啟發式教學

《基因工程藥物》課程的信息量較大，也比較抽象，利用現代的多媒體手段可以形象、細致的展示相關內容，能夠讓學生得到直接的體驗，強低了學習和理解的難度。如播放一些電影、電視節目等，通過討論讓學生說出從基因和自己專業相結合的角度在視頻資料中看到了什么，能想到什么，啟發學生獨立自主的用基因的知識去思考。所以，要多利用、善于利用視頻影像資料，制作精良的課件授課。例如，利用“記者探秘我國甲型H1N1流感疫苗生產過程”的視頻，使學生對于疫苗的制備流程，以及正確使用等有了直觀的、系統的認識；再比如“醫學克隆”一章，首先讓學生觀看《逃離克隆島》片段，然后利用專業知識對電影中的某些細節進行描述，引出克隆在醫學上的應用，使學生能夠從較為專業的角度理解“醫學克隆”，從而達到教學目的。

總之，開設公選課的目的是希望通過授課為學生打開一扇窗，讓他們了解并能夠簡單使用基因工程相關理論，因此，要在啟發學生思維上下功夫，我們甚至可以說，在這門課上學到什么并不十分重要，在學習基因工程藥物的過程中想到了什么才是最重要的。

【參考文獻】

[1]汪燕芳，何俊民，朱云國.談“現代生物技術導論”公選課的開設思路[J].高教論壇，2008（1）.

【作者簡介】

任雪玲，女，河南鄭州人，鄭州大學藥學院副教授、博士，研究方向：基因工程藥物分析.

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[關鍵詞] 傳染性支氣管炎 疫苗 研究

[中圖分類號] S831 [文獻標識碼] A [文章編號] 1003-1650 （2016）08-0247-01

雞傳染性支氣管炎 （IB）是由雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）引起，嚴重危害我國養禽業的一種重要疾病。各年齡階段雞均可發病，但雛雞最為嚴重，一般以40日齡以內的雞多發，產蛋期也有發生。IBV較高的基因突變率造成了IBV 復雜的血清型，目前的血清學交叉中和試驗表明，全世界IBV已有近30個血清型，并仍有不斷上升的趨勢，且各血清型或毒株之間交叉保護性較弱，從而給本病的防控帶來較大的困難，急需研制新的疫苗有效的預防該病的發生。

1 滅活疫苗

滅活疫苗安全性好，不存在散播病原和毒力返強的問題，但是，由于IB血清型的多樣性，單價滅活苗不能阻止IBV變異株引起IB的暴發。王紅寧等（1999）對我國IB的流行病學進行調查研究，試制了多價油乳劑滅活疫苗，擴大常規疫苗的保護范圍，發現能有效地預防多型IB。滅活疫苗的不足之處是使用劑量大，需要配合佐劑， 制備比較復雜、成本較高等。為有效的防治該病的發生，目前，國內多將弱毒疫苗滴鼻和滅活疫苗注射結合起來使用。

2 IB弱毒疫苗

IB 弱毒疫苗是由抗原性良好的毒株通過雞胚連續傳代致弱后制備的凍干疫苗。目前我國廣泛使用M41 血清型的雞胚適應毒H52和H120兩種疫苗。為達到較好的免疫效果，多在早期育雛防控，H120 株疫苗用于雛雞和其它日齡的雞，H52用于經 H120 免疫過的大雞，育成雞開產時選用 H52 疫苗，能有效刺激機體的免疫系統。但鑒于弱毒疫苗有可能成為其突變的主體和重組變異的供體，同時腎型與支氣管炎型的免疫機制還存在著很大的差別，這在很大程度上亦影響著疫苗的免疫保護作用。并且，活疫苗其致弱程度難以掌握，疫苗的運輸、貯存和使用等的條件要求較高。秦玉明等（2009）應用耐熱凍干保護劑研制成功雞傳染性支氣管炎病毒（H52株）耐熱凍干活疫苗，臨床觀察無不良反應，安全有效，且抗原性不變，徹底改變國內獸用生物制品延續了 20多年采用脫脂牛奶制備活疫苗僅-15 ℃保存的歷史，達到國外同類產品的技術水平。

3 基因工程疫苗

3.1 亞單位疫苗

亞單位疫苗是指用基因工程方法構建，在高效表達系統中表達出來強毒病原體的某種免疫相關抗原肽鏈。提取保護性抗原，加入佐劑即制成亞單位疫苗。常用的表達系統為大腸桿菌表達系統、酵母表達系統、昆蟲細胞表達系統和植物表達系統。黃亞東等（2002）構建了含BIV GD6株S1基因的大腸桿菌重組表達載體，并在大腸桿菌中獲得表達。又在畢赤酵母中表達了IBV的S1基因，所表達蛋白的分子量小于天然蛋白。戴亞斌等利用Bac-to- Bac桿狀病毒表達系統構建的重組桿狀病毒，表達了傳染性支氣管炎病毒的S1基因，其在昆蟲細胞中表達的蛋白可以誘導抗體產生中和免疫保護反應。周繼勇等（2003）利用根瘤菌將IBV全長S 基因轉入馬鈴薯中表達，提取免疫原免疫雞，通過3次免疫后，免疫雞受到完全保護。王紅寧等（2003）通過RT-PCR獲得IBV S1基因片段，并將其導入玉米表達載體進行了表達。

3.2 核酸疫苗

核酸疫苗由編碼能引起保護性免疫反應的病原體抗原的基因片段和載體構建而成，在構建多價疫苗方面具有突出的優勢。陳洪巖（1999）、劉思國等（2001）分別將IBV S1基因和N基因構建成真核表達質粒， SPF雞肌肉注射后，結果目的基因在雞體內得到了表達，雞獲得了一定的免疫力。Minglong 用含IBV N 蛋白C末端120 aa 的cDNA 片段的重組質粒接種雛雞，證實了在缺乏S1蛋白時，N 蛋白也可以作為DNA疫苗免疫的目的基因，保護雛雞抵抗急性感染。

3.3 活病毒載體疫苗

活病毒載體疫苗是用利用分子生物學遺傳工程技術將保護性抗原基因整合進載體基因組中，構建成使之表達的重組活載體疫苗。Wang X等（2002）用重組雞痘病毒表達了IBV的S1基因，免疫雞受到部分保護。Yu等（2003）用重組雞痘病毒表達IBV的C末端NL蛋白120個氨基酸進行預防研究，誘導了一些IBV株交叉保護免疫，可以很好的抵制和預防IBV強毒的攻擊。孫永科等（2005）將雞II型干擾素基因和雞傳染性支氣管炎病毒S1基因同時插入到雞痘病毒轉移載體中，重組雞痘病毒疫苗在對雞體的免疫應答中發揮了一定的作用。Johnson MA 等（2003）利用禽 8 型腺病毒表達 IBV S1 基因，對0日齡和6日齡雞分別進行口服免疫，35 日齡時用同型或異型強毒株進行攻毒，試驗結果顯示，對于 IBV 同源和異源毒株在支氣管的保護率達到 90%～100%。

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關鍵詞：基因工程；發展現狀；發展前景；基因工程利弊

一、基因工程

（一）基因工程的概念及發展

1.概念

基因工程又稱基因拼接技術和DNA重組技術，是以分子遺傳學為理論基礎，以分子生物學和微生物學的現代方法為手段，將不同來源的基因按預先設計的藍圖，在體外構建雜種DNA分子，然后導入活細胞，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產新產品。

2.發展

生物學家于20 世紀50 年現了DNA 的雙螺旋結構，從微觀層面更進一步認識了人類及其他生物遺傳的物質載體，這是人類在生物研究方面的一次重大突破。60 年代以后，科學家開始破譯生物遺傳基因的遺傳密碼，簡單地說，就是將控制生物遺傳特征的每一種基因的核苷酸排列順序弄清楚。在搞清楚某些單個基因的核苷酸排列順序基礎上，進而進行有計劃、大規模地對人類、水稻等重要生物體的全部基因圖譜進行測序和詮釋。

（二）基因工程的發展現狀及前景

1.發展現狀

（1）基因工程應用于農業方面。運用基因工程方法，把負責特定的基因轉入農作物中去，構建轉基因植物，有抗病蟲害，抗逆，保鮮，高產，高質的優點。

下面列舉幾個代表性方法。

①增加農作物產品營養價值如：增加種子、塊莖蛋白質含量，改變植物蛋白必需氨基酸比例等。

②提高農作物抗逆性能如：抗病蟲害、抗旱、抗澇、抗除草劑等性能。

③生物固氮的基因工程。若能把禾谷等非豆科植物轉變為能同根瘤菌共生，或具固氮能力，將代替無數個氮肥廠。④增加植物次生代謝產物產率。植物次生代謝產物構成全世界藥物原料的 25% ，如治療瘧疾的奎寧、治療白血病的長春新堿、治療高血壓的東莨菪堿、作為麻醉劑的嗎啡等。

⑤運用轉基因動物技術，可培育畜牧業新品種。

二、基因工程應用于醫藥方面

目前，以基因工程藥物為主導的基因工程應用產業已成為全球發展最快產業之一，前景廣闊。基因工程藥物主要包括細胞因子、抗體、疫苗、激素和寡核甘酸藥物等。對預防人類腫瘤、心血管疾病、遺傳病、糖尿病、包括艾滋病在內的各種傳染病、類風濕疾病等有重要作用。我們最為熟悉的干擾素（IFN）就是一類利用基因工程技術研制成的多功能細胞因子，在臨床上已用于治療白血病、乙肝、丙肝、多發性硬化癥和類風濕關節炎等多種疾病。 并且應用基因工程研制的艾滋病疫苗已完成中試，并進入臨床驗證階段；專門用于治療腫瘤的“腫瘤基因導彈”也將在不久完成研制，它可有目的地尋找并殺死腫瘤，將使癌癥的治愈成為可能。

三、基因工程應用于環保方面

工業發展以及其它人為因素造成的環境污染已遠遠超出了自然界微生物的凈化能力，基因工程技術可提高微生物凈化環境的能力。美國利用DNA 重組技術把降解芳烴、萜烴、多環芳烴、脂肪烴的4 種菌體基因鏈接，轉移到某一菌體中構建出可同時降解4 種有機物的“超級細菌”，用之清除石油污染，在數小時內可將水上浮油中的2/3 烴類降解完，而天然菌株需 1 年之久。90 年代后期問世的DNA 改組技術可以創新基因，并賦予表達產物以新的功能，創造出全新的微生物，如可將降解某一污染物的不同細菌的基因通過PCR 技術全部克隆出來，再利用基因重組技術在體外加工重組，最后導入合適的載體，就有可能產生一種或幾種具有非凡降解能力的超級菌株，從而大大地提高降解效率。

（一）發展前景

基因工程應用重組DNA 技術培育具有改良性狀的糧食作物的工作已初見成效。重組DNA 技術的一個顯著特點是，它注往可以使一個生物獲得與之固有性狀完全無關的新功能，從而引起生物技術學發生革命性的變革，使人們可以在大量擴增的細胞中生產哺乳動物的蛋白質，其意義無疑是相當重大的。將控制這些藥物合成的目的基因克隆出來，轉移到大腸桿菌或其它生物體內進行有效的表達，于是就可以方便地提取到大量的有用藥物。目前在這個領域中已經取得了許多成功的事例，其中最突出的要數重組胰島素的生產。 重組DNA 技術還有力地促進了醫學科學研究的發展。它的影響所及有疾病的臨床診斷、遺傳病的基因治療、新型疫苗的研制以及癌癥和艾滋病的研究等諸多科學，并且均已取得了相當的成就。

（二）基因工程的利與弊

1.基因工程的利

遺傳疾病乃是由于父或母帶有錯誤的基因。基因篩檢法可以快速診斷基因密碼的錯誤；基因治療法則是用基因工程技術來治療這類疾病。產前基因篩檢可以診斷胎兒是否帶有遺傳疾病，這種篩檢法甚至可以診斷試管內受精的胚胎，早至只有兩天大，尚在八個細胞階段的試管胚胎。做法是將其中之一個細胞取出，抽取DNA，偵測其基因是否正常，再決定是否把此胚胎植入母親的子宮發育。胎兒性別同時也可測知。 基因篩檢并不改變人的遺傳組成，但基因治療則會。目前全世界正重視發展永續性農業，希望農業除了具有經濟效益，還要生生不息，不破壞生態環境。基因工程正可幫忙解決這類問題。基因工程可以改良農糧作物的營養成分或增強抗病抗蟲特性。可以增加畜禽類的生長速率、牛羊的泌乳量、改良肉質及脂肪含量等。

2.基因工程的弊

廣泛的基因篩檢將會引起一連串的社會問題。雖然基因篩檢可幫助醫生更早期更有效地治療病人，但可能妨礙他的未來生活就業。基因工程會產生“殺蟲劑”的作物，也可能對大環境有害，它們或許會殺死不可預期的益蟲，影響昆蟲生態的平衡。轉基因食品不同于相同生物來源之傳統食品，遺傳性狀的改變，將可能影響細胞內之蛋白質組成，進而造成成份濃度變化或新的代謝物生成，其結果可能導致有毒物質產生或引起人的過敏癥狀，甚至有人懷疑基因會在人體內發生轉移，造成難以想象的后果。轉基因食品潛在危害包括：食物內所產生的新毒素和過敏原；不自然食物所引起其它損害健康的影響；應用在農作物上的化學藥品增加水和食物的污染；抗除草劑的雜草會產生；疾病的散播跨越物種障礙；農作物的生物多樣化的損失；生態平衡的干擾。

四、結束語

隨著社會科技的進步，基因工程的發展將成為必然。盡管它會給我們帶來一些危害但是仍然為我們帶來了很多好處。不僅為我們提供了新的能源而且促進了各國的經濟的發展，所以在我們發展基因工程的同時應該盡力避免一些危害，而讓有利的方面盡可能應用。

參考文獻：

[1]陳宏.2004.基因工程原理與應用.北京：中國農業 出版社

[2]胡銀崗.2006.植物基因工程.楊凌.西北農林科技大學出版社

[3]劉祥林.聶劉旺.2005.基因工程.北京：科學出版社

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1.了解活疫苗和死疫苗的特點

死疫苗是選用免疫原性好的細菌、病毒、立克次氏體等，經人工培養，再用物理或化學方法將其殺滅制成的。此種疫苗失去繁殖能力，但保留免疫原性。死疫苗進入機體后不能生長繁殖，對機體刺激時間短，要獲得持久免疫力需多次重復接種。死疫苗按佐劑不同分為3種：一是蜂膠佐劑滅活疫苗。蜂膠可增強免疫的效果，減輕注苗反應。這類滅活疫苗作用時間比較快，但制苗工藝要求高，需高濃縮抗原配制。二是油佐劑滅活疫苗。這類疫苗為滅活疫苗，以白油為佐劑乳化而成，大多數病毒性滅活疫苗采用這種方式。油佐劑疫苗注入機體后，疫苗中的抗原物質緩慢釋放，從而延長疫苗的作用時間。三是鋁膠佐劑疫苗。以鋁膠按一定比例混合而成，大多數細菌性滅活疫苗采用這種方式，疫苗作用時間比油佐劑疫苗快。死疫苗一般在2-8℃避光保存，不宜凍結，有效期一年。使用前需充分搖勻，用量較大，對豬體的副作用也大，一般要少量多次接種。其優點是容易保存，安全，毒力不能返強，不存在散毒和造成新疫源的危險，容易制成聯苗。

活疫苗可通過從帶菌者中分離毒力弱的菌株獲得，也可通過人工培養，使微生物產生變異，從毒力弱的菌株中獲得。接種后在體內有生長繁殖能力，接近于自然感染，可激發機體對病原的持久免疫力。活疫苗用量較小，免疫持續時間較長，免疫效果優于死疫苗。大多數的活疫苗都采用冷凍真空干燥的方式凍干保存，以延長疫苗的保存時間，保持疫苗的效價。病毒性凍干疫苗常在- 15℃以下保存，保存期一般為兩年。細菌性凍干疫苗在- 15cc保存時保存期一般為兩年，2-8℃保存時保存期為9個月。當活疫苗接種到豬體后，能在一定部位繁殖一段時期，但由于毒力弱，不會引發疾病，而能使豬體產生免疫力。活疫苗用量少，副作用小，只需接種一次，但不易保存。

2.區分不同情況選用活疫苗或死疫苗

疫苗從來源上又分為免費疫苗和自費疫苗。免費疫苗是指政府免費向養豬戶提供，養豬戶應當依照政府規定的強制免疫項目受種的疫苗；自費疫苗是指由養豬戶自費并且自愿受種的其他疫苗。

免費疫苗有3種：一是口蹄疫病毒疫苗。目前我縣選用的口蹄疫疫苗是一種滅活的疫苗。二是豬瘟疫苗。常用豬瘟細胞活疫苗和脾淋活疫苗，60日齡前基礎免疫可用細胞活疫苗，60日齡后加強免疫可用脾淋活疫苗。三是高致病性藍耳病疫苗。生產實踐證明，陽性豬群使用活疫苗效果更好。

自費疫苗主要有8種：一是豬鏈球菌病疫苗。目前較多使用的豬敗血性鏈球菌病活疫苗對預防C群豬鏈球菌病有很好的效果，而對一些血清型流行比較復雜的地區可考慮使用豬鏈球菌多價滅活疫苗。二是日本乙型腦炎疫苗。用活疫苗可有效防止乙型腦炎的發生。三是豬細小病毒病疫苗。用滅活疫苗較好。四是仔豬大腸桿菌性腹瀉波疫苗。目前常用且效果不錯的有仔豬大腸桿菌基因工程四價滅活疫苗、仔豬大腸桿菌基因工程三價滅活疫苗、仔豬大腸桿菌基因工程二價滅活疫苗等。五是病毒性腹瀉疫苗。常用的疫苗有豬傳染性胃腸炎和豬流行性腹瀉二聯滅活疫苗、豬傳染性胃腸炎和輪狀病毒二聯活疫苗等。六是豬喘氣病疫苗。用進口的豬喘氣病滅活疫苗可取得滿意效果。七是副豬嗜血桿菌病疫苗。可選用油乳劑滅活苗。八是豬偽狂犬病疫苗。用豬偽狂犬病活 疫苗效果更佳。

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1PEA的基礎研究概述

中外學者對PEA的研究已有將近40年的歷史，早期的研究大部分集中在其分子結構及各部分結構的功能等方面。20世紀90年代以來，隨著基因工程技術的飛速發展和分子生物學方法的逐步完善，從綠膿桿菌的基因組全序列入手，對其基因序列與功能的相關性以及利用這一相關性所展開的開發研究得到進一步深化［2］。

1.1PEA的結構和功能PEA是613肽的單鏈毒素蛋白，分子量為66MD，由信號肽和常用肽構成。其常用肽由3個結構功能區組成。功能區Ⅰ又分為大區Ia(第1～252位氨基酸)和小區Ib(第365－399位氨基酸)。三個功能區因其特異的氨基酸序列、分子結構及在肽鏈上的不同位置決定其分別同時行使其細胞毒性所必需的三種不同功能。區Ⅰ和區Ⅲ(第400～613位氨基酸)分別處于PEA分子的氨基端(N端)和羧基端(C端)，分別行使細胞結合功能和ADP－核糖基化作用。區Ⅰ的細胞結合功能主要通過區Ⅰa與靶細胞表面受體結合來實現，區Ⅲ因其含有在三級結構中形成折疊時起決定作用的8個半胱氨酸和4個雙硫鍵而使其成為PEA發揮細胞毒性的關鍵功能區。目前的研究表明，區Ⅰb的大部分即使缺失也不會影響PEA的生物學活性，由此推斷其在PEA細胞毒性中的確切作用尚不明確。功能區Ⅱ(第253～364位氨基酸)包含6個連續的α螺旋，有助其實現毒素的跨膜轉位功能。

1.2PEA的產生、分離、純化和鑒定PEA是綠膿桿菌在其生長增殖過程中產生的一種重要代謝產物，大多數體綠膿桿菌菌株都會生成PEA。但在其液體培養基中PEA含量少，濃度低，提取相當困難。而且不同的綠膿桿菌菌株、不同培養基成分及培養條件等也會影響PEA的合成［3］。分離及純化方法和步驟的微小差異對PEA的純度和收率可能產生較大影響，工業化生產的分離純化方法因考慮到生產規模、操作的方便程度以及生產成本等諸多因素也會與實驗室方法有所不同。

1.2.1PEA的培養方法P.V.Liu首先發現PA－103為綠膿桿菌外毒素高產菌株，并認為它是不產生蛋白酶或很少產生蛋白酶的菌株，此后被公認為PEA標準生產株。P.V.Liu經實驗研究報道了提取PEA的培養方法，即利用胰蛋白酶大豆肉湯透析液作培養基，經培養、離心，取其上清液即為粗毒素。第三軍醫大學的學者用胰酶酪蛋白大豆肉湯培養基(Trypticsoybroth，TSB)，還有學者用TSA甘油培養基振蕩培養綠膿桿菌PA103株，經流水透析、離心，取其上清液制成粗毒素［4］。有報道稱，鐵離子對綠膿桿菌的生長起到一定的促進作用，而對其代謝過程中產生PEA卻有一定的抑制作用［5］。因此，有學者采用細菌生長培養基中加入鐵離子，經離心洗滌2次后轉換到去除鐵離子的產毒培養基中繼續培養，從而解決綠膿桿菌生長需鐵而PEA產生受鐵抑制的矛盾，使PEA產量大幅度提高。軍事醫學科學院微生物流行病研究所梁小兵等為了提高PEA的產量，采用了兩代種子活化法［6］。在生長培養基中加入葡萄糖成分促進綠膿桿菌生長，在產毒培養基中加大甘油含量從而增加PEA的生成，同時在產毒培養基中加入少量NTA防止PEA的迅速降解，保證產毒水平不低于國外報道水平，培育時間比國外學者報告的18h縮短4～6h。

1.2.2PEA的分離、純化和鑒定P.V.Liu通過在粗毒素中加入醋酸、加入飽和硫酸銨、DEAE纖維素柱層析、SephadexG－200柱層析等步驟得到純化PEA;Callahan提出將粗毒素經薄膜超濾法濃縮，再經羥基磷灰石吸附層析、DEAE纖維素離子交換層析、葡聚糖G－150凝膠過濾層析等四步純化法精制了毒素;劉小明等用DE－52纖維素階段洗脫、硫酸銨分級沉淀、SephadexG－25除鹽、DE－52纖維素梯度洗脫、SephadexG－200分子篩層析等四步純化了PEA［7］，劉啟富等用70%飽和硫酸銨沉淀SephadexG－100柱層析，DE－52柱層析，羥基磷灰石柱層析制備PEA［4］。之后有學者提出用聚丙烯酰胺凝膠電泳法純化毒素。但規模生產所用的毒素純化方法還需將DEAE纖維素吸附、飽和硫酸銨沉淀、梯度洗脫、羥基磷灰石柱層析等步驟結合起來才能得到較高收率的純PEA。PEA的鑒定通常采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE)方法。在SDS－PAGE電泳圖譜上，PEA提取物呈現一條主要帶，相對分子質量為66MD。同時用PEA抗血清作免疫印跡分析，得到的抗原性和分子量結果均與文獻報道一致，即可證實純化的蛋白為PEA。

2PEA重組毒素的研究進展

免疫毒素由具有導向能力的“載體”和具有細胞毒性的“彈頭”以一定的連接方式偶聯而成。因其兼有抗體的特異性和毒素的細胞毒作用，所以能夠通過載體準確找到靶細胞，用其攜帶的具有細胞殺傷能力的毒素定向攻擊腫瘤細胞，而對正常組織不產生殺傷作用，因此被形象地稱作“生物導彈”。

2.1對抗體的研究單鏈抗體蛋白的分子量很小(25kD)，使其很容易穿過血管組織和致密的腫瘤屏障，進入實體瘤周圍的微循環。將單鏈抗體與毒素基因重組，由具有導向作用的抗體將毒素攜帶并導入靶細胞，對靶細胞進行特異性殺傷。單鏈抗體與腫瘤抗原的結合有極強的特異性，并具有較低的免疫原性，而且單鏈抗體免疫毒素生產工藝簡單，易于大量生產，是臨床治療腫瘤的理想藥物。但是許多抗原抗體的結合作用都與結合部位相關，從而限制了單價單鏈抗體的應用。為了將單鏈抗體更好地應用于臨床，可引入亮氨酸拉鏈、半胱氨酸及α－螺旋等結構，將單價單鏈抗體加以改造，構建成雙價單鏈抗體分子(dsFv)。dsFv不僅穩定性更強，還具有與單價單鏈抗體相同的特異性和很強的殺傷細胞毒素活性。另有學者為了降低抗體的鼠源性，增強其親和性，將具有較強特異性和親和力的鼠類抗原加以改造，制成具有完整抗體結構的人－鼠工程抗體，應用于臨床將是更加實際有效的方法，也是重組毒素抗體研究的發展方向。

2.2對毒素的研究生物導彈(重組毒素)常用的彈頭(毒素)有兩類:一類是植物毒素，包括苦瓜毒素(MD)、篦麻籽毒素(RT)、相思子毒素(abrin)等。另一類是細胞毒素，包括白喉毒素(DT)、綠膿桿菌外毒素(PE)。綠膿桿菌外毒素A因其極強的細胞毒性通常被用作重組毒素的“彈頭”部分，其毒性本質是它能夠催化真核細胞延伸因子－2的ADP核糖基化，阻止肽鏈延長中斷細胞蛋白質合成而行使細胞毒作用。重組免疫毒素常用的綠膿桿菌外毒素是PE40，它是將PE分子去除Ⅰa區產生的。將PE40和特異性抗體相連接制成重組毒素，對受體細胞具有強烈殺傷性。但此類免疫毒素有實體瘤穿透率低，體內半衰期短的弊端，并且免疫毒素本身具有一定的毒副作用。因此，學者們應用基因工程手段通過改造PE分子結構來改善重組毒素的性狀。目前應用于重組毒素的綠膿桿菌外毒素的突變體有PE38、PE38KDEL、PE35等幾種［8］。這些衍生物雖然減少了非特異結合，但仍會對正常細胞和組織造成傷害。一些免疫毒素由于半衰期較短，會嚴重損害血管內皮細胞，造成血管滲漏綜合癥(VascularLeakSyndrome)。目前，已有學者對重組毒素蛋白的質控方法和質量標準進行了研究，為重組蛋白的批量生產和臨床應用奠定了基礎。史新昌等采用結晶紫比色法和反相高效液相色潛法(RP－HPLC)分別測定GP38蛋白的生物學活性和純度，建立人性腺激素釋放激素類似物－PEA功能片段重組蛋白GP38的質量標準和質控方法，不僅可用于GP38蛋白產品的常規檢定，還可為其他重組蛋白的檢定提供理論依據［9］。

2.3存在的問題及前景展望重組免疫毒素的特異性較高，細胞毒活性較強，用于靶向治療腫瘤不僅療效好，而且副作用低，是一種前景廣闊的癌癥治療藥物。但其存在體內半衰期較短，血管滲漏綜合征出現率高，免疫原性較高的弊端，而且目前所用的單克隆抗體多為鼠源性，人體使用后會產生抗鼠源單克隆抗體的抗體，這些因素都限制了免疫毒素的反復應用。重組毒素免疫原性高的根源在于其分子量較大，一般都在35kD以上，所以尋找小型毒肽替代PE40已經成為一種必然。用基因工程的方法，對抗體和毒素進行改造，使鼠源抗體人源化并弱化毒素免疫原性，是完善和發展重組毒素導向治療的研究方向，可使免疫毒素成為攻克癌癥頑疾的首選藥物。一種新型基因工程免疫毒素是將毒素基因接入表達質粒，通過堿性的魚精蛋白將質粒與scFv相互連接，scFv將質粒引導至靶細胞，通過預先設計可使毒素在胞內的表達受控于可誘導的或靶細胞特異性啟動子。這種基因工程抗體可以有效彌補抗原的相對特異性不足，使毒素更有選擇性地到達靶細胞。一種新型的胞內抗體以mRNA形式由逆轉錄病毒、腺病毒等載體送達到靶細胞，翻譯成抗體，使某些腫瘤細胞基因蛋白失活。這種新型抗體免疫原性大大降低，可作為載體廣泛應用于重組毒素。劉綺明等經過研究獲得了PEA常用肽上各氨基酸殘基與抗原性的相對關系數據;通過對PEA常用肽上的6個關鍵區域分別置換1～2個氨基酸的方法，顯著降低了PEA的抗原性，為構建安全有效的免疫毒素的奠定了基礎。

3綠膿桿菌疫苗的研究進展

3.1傳統綠膿桿菌疫苗的研究傳統的細菌疫苗多注重在刺激宿主產生抗體，以對抗病原菌或加強巨噬細胞的噬菌能力，進而阻止細菌在患者體內繁衍。

3.1.1內毒素蛋白多價疫苗敬德仲等從我國11個血清型和美國Fisher7個血清型綠膿桿菌菌株中提取內毒素蛋白，篩選出攻擊耐受性最強的三種血清型的綠膿桿菌內毒素蛋白制成三價疫苗，綠膿菌素免疫耐受力為4～500LD50。經北京、天津、重慶、黑龍江等32家醫院400余例臨床療效觀察，治療綠膿桿菌感染總有效率達83.7%。

3．1.2超免疫血漿的研究超免疫血漿用于綠膿桿菌易感者的預防和綠膿桿菌感染的治療，如燒傷、創傷、手術后以及呼吸道、尿路等綠膿桿菌感染的預防及治療。20世紀80年代，黑龍江省科學院微生物研究所與上海亞太輸血中心、瑞金醫院協作研制了人用綠膿桿菌超免疫血漿。經47例嚴重燒傷患者臨床實驗(治療組26例，應用綠膿桿菌超免疫血漿;對照組21例，用常規治療。)結果治療組有1例死于綠膿桿菌感染(3.8%)，而對照組8例死于綠膿桿菌感染(38.1%)。衛生部成都生物制品研究所與中國人民第三軍醫大學研制的抗綠膿桿菌凍干免疫血漿經動物實驗和臨床使用，證明不僅對同群菌株攻擊有良好的保護作用，而且對異群菌株攻擊也有較好的保護作用。經臨床應用于嚴重燒傷患者有效率為81.5%，應用于呼吸道感染病人有效率為90%。目前，凍干綠膿桿菌超免疫血漿的市場需求越來越大，有專門信息咨詢機構定期對凍干抗綠膿桿菌人血漿行業的整體及其相關子行業的運行情況進行調研，并對其未來的發展趨勢和前景進行分析和預測［10］。作為治療綠膿桿菌感染的輔助制劑，抗綠膿桿菌凍干免疫血漿因其能有效對抗耐藥菌株而得到更多專家學者的關注。

3.1.3脂多糖疫苗的研究綠膿桿菌脂多糖疫苗是由6個血清型菌株提取的脂多糖組成的聯合疫苗，它可剌激機體產生體液抗體，增強嗜中性白細胞的吞噬功能。應用于231例綠膿桿菌感染癥患者的臨床治療證明，這種疫苗對燒傷感染、中耳炎等綠膿菌感染病癥的治療總有效率達90%以上，對我國綠膿桿菌11個血清型標準株有較好的保護作用。該疫苗不僅安全性高、而且毒性和副作用小，是我國治療綠膿桿菌感染癥的一種新藥［11，12］。

3.2綠膿桿菌多聯疫苗的研究綠膿桿菌感染宿主的途徑多種多樣，產生的臨床癥狀也各不相同，而綠膿桿菌在繁殖過程中所產生的多種有毒代謝產物，對各種臨床癥狀也有不同程度的影響，尤其是綠膿桿菌的主要致病因子—外毒素A對機體的傷害最大。傳統的幾種綠膿桿菌疫苗因其抗體種類單一而不能有效預防和治療綠膿桿菌外毒素A對機體造成的病害，無法對患者提供足夠的保護作用。近年來，有學者嘗試研究了一種包含了綠膿桿菌外毒素A、外膜蛋白、彈性蛋白和堿性蛋白所制備的類毒素等多成分的綠膿桿菌多聯疫苗。此疫苗無毒性且抗原性穩定，在水貂和人類體內的初步測試，證實可以刺激宿主細胞產生抗體，中和綠膿桿菌產生的多種有毒代謝產物，而且可以增強巨噬細胞的吞噬功能。但這種多成分的疫苗不但制造麻煩，而且很難控制每種成分的比例、含量，在接種疫苗后，免疫的效果差異也很大。

3.3基因工程疫苗的研究綠膿桿菌外毒素A是綠膿桿菌致病的最重要的內在機制，嚴重感染綠膿桿菌但能夠存活下來的患者，其體內的抗綠膿桿菌外毒素A抗體的濃度都很高;因感染而死亡的患者，其體內卻含有較低濃度的抗綠膿桿菌外毒素A抗體。此外，免疫力低下的患者可以通過使用抗綠膿桿菌外毒素A抗體使自己免受綠膿桿菌感染的威脅。但是綠膿桿菌外毒素A的毒性很強，如何利用基因工程方法降低或消除PEA的毒性，發展更安全、有效的綠膿桿菌疫苗，是科學家的研究重點之一。

3.3.1PEA毒性的消除方法以往消除PEA毒性都是用福爾馬林處理，使其蛋白變性，制成沒有毒性的類毒素。再用類毒素免疫家兔，產生免疫應答后取兔血，血清即為抗PEA抗體。這種減毒方法仍有可能產生有害的毒素。因此就有科學家利用基因工程的技術讓綠膿桿菌外毒素A的毒性消失，但仍然保留大部分抗原性，而成為無毒性的綠膿桿菌外毒素A類毒素。利用這種類毒素，可以有效刺激機體產生抗體，中和綠膿桿菌外毒素A的毒害作用。這比先前用福爾馬林處理綠膿桿菌外毒素A制造類毒素疫苗的傳統方法更安全，而且抗原性也較強。

3.3.2重組融合蛋白疫苗利用基因工程技術消除綠膿桿菌外毒素A的毒性區域，用綠膿桿菌的多種外膜蛋白替代這一區域，形成一種多成分綠膿桿菌疫苗，即重組融合蛋白疫苗。動物實驗表明這種疫苗確實可以刺激宿主產生與細菌表面抗原結合的特異性抗體，并能夠促進巨噬細胞的吞噬作用，還可以對抗外膜蛋白產生免疫力，能夠抵抗所有不同血清型的綠膿桿菌的感染，因此是一種更有效的新型綠膿桿菌疫苗。

3.3.3基因工程亞單位疫苗基因工程亞單位疫苗(Subunitvaccine)是利用DNA重組技術，將編碼病原微生物保護性抗原的基因導入受體菌(如大腸桿菌)或細胞，并在受體中高效表達，分泌保護性抗原肽鏈。將保護性抗原肽鏈提取出來，加入佐劑即制成基因工程亞單位疫苗。它能克服一些常規疫苗的缺陷，代表了疫苗發展的一個新途徑［13］。

3.4PA－MSHA菌毛株疫苗綠膿桿菌－甘露糖敏感血凝(PA－MSHA)菌毛株疫苗常被稱作“綠膿桿菌制劑”，是一種能全面提高及調整癌癥患者的體液免疫和細胞免疫功能，增強抑制和殺傷癌細胞效應的新型細菌性免疫調節劑(或稱PA－MSHA免疫調節劑)，是癌癥患者理想的輔助治療藥物。這種疫苗常被用作急性白血病、惡性淋巴瘤、肺癌的輔助治療藥物，在乳腺癌的治療上也取得了很好的療效［14，15］。此外，英國研制出一種用于治療綠膿桿菌感染的口服型疫苗。通過成人志愿者小人群臨床試驗證明，口服接種免疫后，血清IgA水平提高并能促進機體產生并增強吞噬綠膿桿菌的能力，口服適宜劑量的此疫苗在人體內是安全的并且具有免疫原性。此疫苗還有望治療纖維囊腫病人，消除這些病人肺部寄生的綠膿桿菌，避免呼吸衰竭而導致的死亡。除了人用綠膿桿菌疫苗以外，還有學者對動物綠膿桿菌感染性疾病進行了發病情況和流行特點調查，研制了多種疫苗對抗綠膿桿菌的感染，其中以滅活菌苗為主。有學者利用綠膿菌外膜蛋白疫苗和基因工程疫苗有提供共同保護性抗原的優點，將其應用于預防水貂出血性肺炎上，取得了較好效果［16］。

4PEA的應用綠膿桿菌外毒素A除了具有“與抗體結合制成免疫重組毒素用于靶向治療”以及“開發各種綠膿桿菌疫苗以預防和治療綠膿桿菌感染”的用途外，在食品中綠膿桿菌的鑒定、癌癥治療及作為抗原攜帶蛋白生產去勢疫苗等方面都有廣闊的應用前景。

4.1在菌種鑒定和檢測方面的應用目前綠膿桿菌菌種鑒定方法主要依據其生理生化特性用生物學方法實現，但該方法周期長，步驟多且復雜，使其在食品衛生領域綠膿菌的鑒定受到限制。北京農學院的艾啟俊等應用PCR技術研究設計了一種鑒定食品中綠膿桿菌感染的方法。他們根據編碼綠膿桿菌外毒素A基因設計引物，通過PCR方法擴增出外毒素A基因［17］。此方法可從金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、乳酸菌、大腸桿菌菌液異性地檢出綠膿桿菌外毒素A基因。該方法操作簡單、靈敏度高，可檢測到含量為3cfu/mL的綠膿桿菌，同時還有快速、特異性強等特點，也可用作臨床標本細菌感染中綠膿桿菌的鑒定。山東農業大學的高玲美等用過碘酸鈉法將過氧化物酶標記抗PEA抗體(IgG)，制成酶標抗體，通過平板凝集實驗法和酶標抗體ELISA法對照實驗，對羊體內抗PEA抗體含量進行了檢測。結果證明，酶標抗體ELISA法檢測的抗體效價要比平板凝集實驗法平均高出2個滴度，表明制備的PEA酶標抗體具有靈敏度高、特異性強的優點［18］。這種技術已被開發制成人綠膿桿菌外毒素A(PEA)酶聯免疫試劑盒，并已廣泛應用于樣品中綠膿桿菌外毒素A濃度的檢測。

4.2在動物生育調控方面的應用綠膿桿菌外毒素A是一種有效的抗原攜帶蛋白，藉由綠膿桿菌外毒素A能夠攜帶蛋白質的特性，可將其應用到除PEA以外的其它不同疫苗的研究上，以提升該抗原的免疫效果。例如利用重組DNA的方法，把去毒性的綠膿桿菌外毒素A作為攜帶蛋白與促性腺素釋放激素(Gonadotropin－releasinghormone，GnRH)接合，用細菌作為生產去勢疫苗的載體，免疫后的動物都能夠產生很強的抗GnRH的抗體，抑制該動物的性腺發育和生殖功能。與外科手術去勢的方法相比較，去勢疫苗不僅方便有效、簡單易行，而且降低了對動物機體的傷害和去勢成本，是一種具有發展前景的去勢手段。

4.3在癌癥治療上的應用對于癌癥的治療，現行的放療和化療方法沒有特異性，對人體的傷害很大。而靶向重組毒素因其特異性強，副作用小，成為必然替代放療和化療方法治療癌癥的新型藥物。目前，利用重組毒素治療癌癥治療的研究已在國內外專家的努力下取得了實質性進展，但大多數處于動物實驗階段，還沒有廣泛應用于臨床。

4.3.1PEA細胞毒作用在癌癥治療上的應用利用綠膿桿菌外毒素A極強的細胞毒作用，可將其用作靶向重組毒素的彈頭部分。張鴻等研究了促黃體激素釋放激素(LHBH)基因與綠膿桿菌外毒素A(PE40)基因重組蛋白(LHBH－PE40)對非小細胞肺癌細胞A549的毒性作用，發現LHRH－PE40可以誘導A549細胞凋亡［19］。燕翔等通過實驗研究得到基因重組轉化生長因子α－綠膿桿菌外毒素融合蛋白(TGFα－PE40，簡稱TP40)對人膀胱癌細胞的生長具有劑量、時間依賴性抑制作用的結論［20］。姜洋等經研究發現重組人促黃體激素釋放激素－綠膿桿菌外毒素A(LHRH－PE40)對過度表達LHRH受體的胃癌均具有特異有效的抗腫瘤活性［21］。還有更多的學者利用基因工程技術合成了用于治療各種癌癥的重組毒素，如新型肝癌免疫毒素A54－PE40KDEL［22］，并通過動物試驗或體外試驗證實具有毒殺癌細胞的作用。此外，有學者利用PEA細胞毒作用制成重組免疫毒素，用以治療其他疾病。李勝濤將與FcεRI高度結合的人IgE的Fc片段作為靶向部份與PEA偶聯，組成靶向免疫毒素，對肥大細胞有凋亡作用，用以治療過敏性疾病［23］。

4.3.2PEA作為蛋白質攜帶載體在癌癥治療上的應用利用綠膿桿菌外毒素A能夠攜帶蛋白質或DNA進入細胞中的特殊功能，還可將其用作載體開發出極佳的基因治療工具或蛋白質治療藥物。馬超等利用外毒素結構域Ⅰa基因表達蛋白的佐劑效應，構建綠膿桿菌外毒素A與Ⅱ型單純皰疹病毒糖蛋白嵌合蛋白表達載體，經動物實驗證實，此嵌合表達蛋白可誘導產生抗HSV－2特異性抗體并具有較強的免疫原性［24］。劉艷華等應用綠膿桿菌外毒素的結構域Ⅱ(PEⅡ)的轉膜效應，構建了以Ⅰ型促性腺激素釋放激素(GnRHⅠ)為導向部分，以絲瓜毒素luffinS2為毒性部分的重組嵌合毒素GnRH－PEⅡ－luffinS，體外實驗證實其對腫瘤細胞有顯著殺傷作用［25］。還有學者成功地構建了毒性基因缺失的PEA與人組蛋白H4融合基因的原核表達載體，為進一步表達并獲得大量的融合蛋白奠定了基礎［26］。

4.3.3PEA的超抗原特性在治療癌癥上的應用PEA是由綠膿桿菌分泌的一種可溶性蛋白質，可大量激活T淋巴細胞，屬外源性超抗原。超抗原對免疫系統的影響很大，無論是急性效應(包括食物中毒和中毒性休克綜合征)還是長期效應(包括自身免疫性疾病和免疫缺陷)通常對機體都是有害的，但如果合理利用其“能迅速激活大量T淋巴細胞”的特性，超抗原可以增強機體的免疫反應，對機體產生積極的作用。利用PEA的這一特性，學者們將其應用于腫瘤治療中可獲得明顯的療效。PEA超抗原通過大量激活細胞毒性T淋巴細胞(CTL)與NK細胞，使得這兩種細胞參與的免疫細胞介導的殺腫瘤細胞活性相應增強。此外，被激活的大量T淋巴細胞會分泌一種具有抗增殖作用的IFN2γ，也促進了這種抗腫瘤活性的增強。重組毒素除了應用在抗腫瘤、治療自身免疫性疾病等方面，還在其他疾病的治療或預防上發揮作用。有學者將甲型流感病毒M2蛋白胞外區與銅綠假單胞菌外毒素A相融合，并構建融合蛋白的原核表達載體，免疫小鼠后再用流感病毒A/PR/34/8株攻擊小鼠。經檢測發現，這種方法能夠抑制病毒在肺內的復制。此項研究為甲型流感病毒廣譜疫苗的進一步研發打下了基礎［27］。

篇(7)

雖然血源性乙肝疫苗在控制乙肝方面發揮了重要作用，但它并非十全十美，應用之初，就顯露了其本身的一些缺點。其一，來源有限，無法大規模穩定生產；其二，在HBsAg 陽性血漿采集、運輸和加工過程中，有可能造成環境污染及乙肝病病毒傳播；其三，盡管疫苗生產過程中采用三步滅活工藝，應用后至今未發展1人因注射疫苗而發病，但極難確保所有潛在性致病因子（特別是未知的致病因子）均被滅活；其四，生產中需要較高的純化抗原技術及滅活要求，成本較高，并影響疫苗的免疫原性。有鑒于此，并影響疫苗的免疫原性。有鑒于此，血源性乙肝疫苗只能作為一種過度性疫苗，尚需開發新型疫苗。

70年代末期，在乙肝病毒的基因序列已基本弄清的基礎上，不少國家開始研究基因工程疫苗。1986年，美國一家公司用酵母表達的HBsAg基因工程疫苗投產。此后，重組細胞疫苗、多肽疫苗等。也相繼問世。上述疫苗的制備不需要合適的血漿，也不需要采取針對致病因子的滅活措施，因而可以高效穩定地大規模工業化生產，且安全性更高，價格較便宜。從實際接種的效果看，基因工程疫苗的保護率與血源性疫苗相同，其抗體陽轉率在95%以上，母嬰傳播阻斷率在85%以上，能夠顯著降低乙肝病毒的感染率和攜帶率，且無嚴重不良反應，是安全而有效的免疫制劑。

與此同時，國內外對乙肝疫苗的接種方法進行了大量研究，目前各國的接種方案就是根據這些研究成果制定的。1991年我國頌布了乙肝免疫方案：

1. 接種對象：

對乙肝的深入研究證實，感染乙肝病毒的年齡越小，成為慢性持續性感染的可能性越大。如果在1歲以內感染，將導致70-90%的嬰兒成為乙肝病毒攜帶者；如果在2-3歲感染，將有40-70%的兒童成為攜帶者；如果在4-6歲時感染，有10-40%的兒童成為攜帶者；如果在7歲以上感染，只有6-10%變成攜帶者。也就是說，新生兒時期預防乙肝效果最好。

因此，我國的乙肝免疫方案要求全體新生兒接種乙肝疫苗，在條件許可的情況下擴大到學齡前兒童。

2. 免疫途徑：

乙肝疫苗的接種途徑包括肌肉、皮下和皮內注射數種；肌肉注射又分上臂三角肌和臀部兩種。目前多采用肌肉注射方法，注射部位以上臂三角肌為宜。

3. 免疫程序與劑量：

我國的乙肝免疫方案規定，接種程序為0、1、6月三針間隔接種。"0"指新生兒出生后24小時內的第一針，對其他兒童或成年人則為第一針起始時間；"1"為間隔1個月接種第三針；"6"指第一針后的6個月接種第三針。應當強調，三針疫苗必須按時注射，特別是第一針一定要及時注射，應用越早，效果越好；第二針如果因故未能按規定時間注射，略晚幾天也可以，但不得超過8周；第三針為加強免疫，也應按時接種，因故提前1個月或延后1-2個月亦可，但最遲不能超過10個月。

4.加強接種問題：