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達情況，著重觀察單個細胞培養形成細胞克隆的形態與時間。結果 以有限稀釋法獲取192個Tca8113M1舌癌單個細胞，在96孔板中進行體外培養，獲取12個細胞亞系（獲取比例為6.25%），均有高成瘤性。癌干細胞相關標志CD44

與ESA均為高水平表達，而CD184表達則在12個細胞系之間有差異。在單個細胞培養中，形成完全克隆、部分克隆與旁克隆3種形態，12個細胞亞系均源于單個細胞形成的完全克隆，均可進行連續傳代與擴增，而部分克隆與旁克隆則在后續培養中逐漸衰老與消亡。結論 Tca8113M1細胞系中可能存在癌干細胞，而單細胞培養可形成完全克隆并建立細胞亞系，是進行舌癌干細胞后續研究重要的細胞培養模式。

[關鍵詞] 單細胞； 有限稀釋法； 舌癌干細胞； 完全克隆

[中圖分類號] Q 21 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.01.021 癌干細胞是癌組織中一小群具有干細胞特性的細胞，具有自我復制與更新的能力，而且增殖與分裂能力極強，少量細胞即可形成體外移植瘤[1]。近年

有關腫瘤發生、轉移、耐藥與復發等諸多難題均從癌干細胞的角度進行研究。這種研究的基礎和前提是明確癌干細胞的標志或分離出癌干細胞，以提供研究的靶細胞。目前已發現多種永生性癌細胞系中存在有癌干細胞，Tca8113M1舌癌細胞系同樣可能存在有癌干細胞，可以作為舌癌干細胞的研究對象。鑒于癌干細胞獨特的自我復制與更新能力，本研究以Tca8113M1舌癌細胞系為研究對象，采用有限稀釋法分離出單個舌癌細胞進行體外培養，利用癌干細胞的自我復制能力進行分裂增殖，形成預期的單細胞克隆，進一步形成細胞亞系，以此證明Tca8113M1

舌癌細胞系中存在癌干細胞的可能性，同時檢測細胞亞系癌干細胞標志的表達情況，觀察不同細胞亞系的生物學特性，并且動態觀察單細胞培養中細胞克隆形成的規律，為從Tca8113M1細胞系中分離舌癌干細胞提供前期實驗依據。

1 材料和方法

1.1 舌癌細胞系來源

人舌癌細胞系Tca8113由上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院口腔頜面外科腫瘤生物實驗室建系，四川大學華西口腔醫院贈送。右江民族醫學院腫瘤分子生物學實驗室在此基礎上建立了轉移人舌癌細胞系Tca8113M1[2]。

1.2 主要試劑和儀器

胎牛血清（Hyclone公司，美國），RPMI1640培

養基（Gibco公司，美國）；PE標記抗人CD44抗體，異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）標記的抗人細胞外可溶性抗原（extracellular soluble anti-

gen，ESA）抗體，PE/cy5標記抗人CD184抗體，同

型對照抗體分別為大鼠IgG2bκ2、小鼠IgG1與小鼠IgG2aκ4。CO2培養箱（日本三洋公司），流式細胞儀（BD公司，美國），倒置顯微鏡（Olympus公司，日

本）。

1.3 體外單細胞培養、建系及細胞克隆生長的動態

觀察

采用有限稀釋法進行體外單細胞培養與建系。Tca8113M1細胞經復蘇后，使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基在37 ℃、5%CO2培養箱中培養。用0.25%胰蛋白酶消化細胞制備細胞懸液，轉移至96孔板，采用有限稀釋法保證每個孔有1個細胞，在倒置顯微鏡下觀察其生長和增殖情況，待其生長成多個細胞克隆后，用0.25%胰蛋白酶消化轉移至6孔板擴增培養后，在培養瓶中反復傳代建立細胞亞系。此外，在此培養過程中動態觀察單個細胞形成細胞克隆的形態與生長情況，觀察時點分別為3 d和1、2、3周。

1.4 舌癌細胞亞系成瘤性檢測

建立裸鼠皮下移植瘤模型。體外培養Tca8113、Tca8113M1、Tca8113M1舌癌細胞亞系細胞，選取形態良好的生長期細胞，在生長旺盛時接種。具體步驟如下：消化收集舌癌細胞，800 r?min-1離心3～

5 min，棄上清液，計數細胞總量，以含10%胎牛血清的DMEM培養液按每毫升1×107個細胞的密度稀釋細胞；消毒裸鼠右腋窩的皮膚，將細胞接種于皮下，以皮下結節直徑超過1.0 cm為成瘤標準。共接種裸鼠45只，具體分組如下：1）Tca8113M1舌癌細胞亞系組，共12個亞系，每組3只，共36只；2）Tca8113M1舌癌細胞組，6只，為母系細胞系對照組；3）Tca8113舌癌細胞組，3只，為來源細胞系對照組。

1.5 流式細胞術檢測舌癌細胞亞系癌干細胞相關標

志CD44、CD184、ESA的表達情況

將舌癌細胞（密度為每毫升1×106個）消化以后，800 r?min-1離心5 min，棄上清液，加入D-hanks液重懸，盡量將細胞吹散，將細胞懸液分別移入試管中（每管體積為500 μL），設置對照管和樣本管。在對照管中加入同型對照抗體（分別是大鼠IgG2bκ2、小鼠

IgG1與小鼠IgG2aκ4）各5 μL，在樣本管中加入熒光抗體（PE標記抗人CD44、FITC標記抗人ESA、PE/cy5

標記抗人CD184）各5 μL，置于避光環境下室溫孵育30 min，然后于流式細胞儀上檢測CD44、CD184、ESA的表達情況。

2 結果

2.1 Tca8113M1細胞體外單細胞建系培養

Tca8113M1單細胞培養12 h后，細胞貼壁；24 h后部分細胞出現變大變薄、空泡樣變等老化現象；3 d后，有7個孔的細胞出現增殖分裂現象；7～10 d后有12個孔的細胞開始增殖為單個或數個完全細胞克?。寺⌒纬蛇^程見圖l）。

培養4～6周后，細胞基本達到穩定生長并增殖的狀態，以癌細胞的克隆樣生長為主，細胞呈鋪路石狀，可見巨核、多核細胞，核分裂象多見。待培養孔接近80%鋪滿時，將細胞轉移至6孔板上擴增培養，1～2周后轉移至培養瓶中繼續傳代培養，穩定傳代30代后凍存。本研究以有限稀釋法獲取192個Tca8113M1舌癌單細胞，并在96孔板中進行體外傳代建系培養，獲取12個細胞亞系，比例為6.25%，分別命名為Tca8113-S1～Tca8113-S12。

2.2 Tca8113M1細胞體外單細胞培養形成細胞克隆

的動態觀察

以3 d和1、2、3周為觀察時點，發現單個細胞形成細胞克隆的形態主要有3種：完全克隆、部分克隆、旁克隆。Tca8113-S1～Tca8113-S12細胞亞系的細胞均源于單個細胞形成的完全克隆，均可以進行連續傳代與細胞培養擴增，而其他單個細胞培養形成的部分克隆與旁克隆則在后續培養中逐漸衰老與消亡，未能連續傳代進行細胞擴增。3種克隆在培養過程中的變化情況如下。1）完全克?。杭毎g緊湊密集成型，增殖速度快，其中1～2周為典型的完全克隆狀，3周時在細胞克隆中央出現細胞重疊生長現象（圖2中A1～A4）；2）部分克?。嚎寺⌒螒B界于旁克隆與完全克隆之間，細胞間較疏松，其中1～2周為典型的部分克隆狀，但第3周細胞克隆疏松，形狀消散，

有轉變為旁克隆的趨勢（圖2中B1～B4）；3）旁克?。?/p>

細胞間疏松不成型，第1周較典型，第2、3周后細胞老化（圖2中C1～C4）。

2.3 Tca8113M1舌癌細胞亞系成瘤情況

將舌癌細胞亞系Tca8113-S1～Tca8113-S12接種于裸鼠皮下后，1周后可觸及皮下結節，表面光滑、質硬、可活動；2周后可見皮下結節生長迅速；3～4周后皮下結節最大直徑達1.0 cm以上。含對照組在內的45只裸鼠均接種成瘤，成瘤率為100%。

2.4 流式細胞術檢測細胞亞系癌干細胞相關標志

CD44、CD184、ESA表達情況

流式細胞術檢測結果見表1：除了Tca8113-S1、Tca8113-S6與Tca8113-S10的ESA陽性表達率分別為60.7%±3.6%、74.1%±1.5%與65.3%±2.8%外，其余細胞亞系ESA的陽性表達率均在80%以上；各亞系CD44陽性表達率均很高，除了Tca8113-S7為68.9%±2.4%外，其余亞系的陽性率均在90%以上；12個亞系的CD184表達存在差異，陽性率在14.8%±3.5%至74.4%±1.5%之間波動。

3 討論

本研究利用有限稀釋法等經典的細胞培養技術，以舌癌Tca8113M1細胞系為研究對象，隨機選取192個舌癌細胞，在96孔板中進行單細胞培養，經過長期傳代培養，共建立12個舌癌Tca8113細胞亞系，比例為6.25%，而且都具備很強的成瘤性。進一步檢測12個Tca8113細胞亞系的癌干細胞相關標志，結果發現：CD44與ESA均為高水平表達，陽性表達率多在90%左右，而CD184的陽性表達率則各有不同。據此結果可以結合癌干細胞的生物學特性對本實驗獲得的細胞系進行分析。

本研究發現：舌癌Tca8113M1細胞系中有6.25%的單個細胞可以進行自我分裂、增殖，形成細胞亞系。還有研究[3]發現：Tca8113細胞連續經過兩次單細胞培養實驗，其中具備分裂增殖活性的細胞比例為5.09%～10.85%。這提示即使在永生化細胞系中，具備持續增殖能力的細胞占整個群體的比例都較少。根據目前的文獻[4]報道，在癌細胞群或組織中，癌干

細胞比例為0.01%～5%；體外培養的永生化癌干細胞系中，癌干細胞的比例可能偏高一些。本研究采用經典的有限稀釋法獲取單個細胞，這種細胞表現出強大的增殖與分裂活力，而且還形成了成瘤性很強的細胞亞系。這些單個培養的細胞是否就是癌干細胞尚需進行單細胞水平的鑒定，但可以大膽推測的是，其中應該包含有癌干細胞。腫瘤干細胞的概念于20世紀60年代提出，并據此建立了腫瘤細胞克隆實驗。本研究在單個細胞培養中也發現，單細胞的增殖方式是克隆樣增殖，即形成一個細胞克隆后擴大生長，并且在周圍形成小的細胞克隆，最后融合成片，但究其細胞來源就是一個癌細胞而已，所有后續的細胞克隆與癌細胞就是源于它，所以可以認為該細胞具有癌干細胞的潛質，可以考慮從癌細胞系中篩選癌干細胞。

在12個Tca8113細胞亞系中，為明確其癌干細胞相關標志的表達情況，為后續舌癌干細胞的篩選提供前期實驗數據，本研究綜合文獻報道，選取了CD44、ESA與CD184等癌干細胞相關標志進行檢測。CD44是乳腺癌、頭頸部腫瘤、結腸癌等上皮組織的癌干細胞的相關標志，CD184是胰腺癌干細胞的相關標志；ESA則是上皮來源的癌干細胞標志，而且屬于細胞黏附分子[5-6]。在本研究建立的12個細胞亞系中，

CD44與ESA均處于高水平表達，而CD184的表達則高低不一，其中亞系間均數差值最大者接近60%。從這3個指標的表達情況來分析，可以進行如下推測：1）CD44與ESA是不同細胞亞系共有的標志，提示這些細胞亞系可能具有共同的組織起源；2）CD184的差異性表達提示Tca8113細胞系中存在細胞異質性，但從其比例來看，大致有3個等級，即15%、30%、50%以上，提示其生物學特性可能有明顯的差別，但可作為舌癌干細胞研究的候選細胞群體進行研究。

此外，在單個細胞培養基礎上建立細胞亞系的過程中，筆者發現單個細胞形成細胞克隆的形態與細胞最后成系關系密切。在單個細胞形成完全克隆、部分克隆以及旁克隆等3種克隆形式中，只有完全克隆能夠形成細胞亞系，而且這些細胞亞系表現出腫瘤的異質性與成瘤性，而部分克隆以及旁克隆則在傳代與擴增培養過程中逐漸老化或消亡。這一結果可進行逆向推理：將最初形成完全克隆的12個細胞確定為舌癌干細胞，而其形成的完全克隆則是癌干細胞自我更新與增殖的結果，其中可能富含癌干細胞。這一觀點也為前列腺癌、小鼠肉瘤、胰腺癌以及神經膠質瘤等相關研究[7-12]所證實。這些研究發現完全克隆細胞可以高表達癌干細胞標志；接種1 000個完全克隆前列腺癌細胞就可形成移植瘤；通過懸浮球培養的癌細胞球在消化后進行單細胞培養，可以形成高比例的完全克隆。有學者[13]進一步在頭頸腫瘤細胞系中發現，CD133與CD44陽性表達的癌細胞多形成完全克隆，而CD133與CD44陰性的癌細胞則多趨向于形成部分克隆或旁克隆，從而認為CD133與CD44是頭頸腫瘤癌干細胞的標志。由此可見，完全克隆為癌干細胞的自我更新方式與富集、純化癌

干細胞及癌干細胞標志的研究提供了新的途徑，近年在癌干細胞研究中逐漸被應用和關注[11]。此外，針對完全克隆的研究切入時間與方式也需要注意。在本研究中，典型的完全克隆在單個細胞培養1～2周時形成，最好不要超過3周；擴增培養后，可使癌干細胞比例減少或分化細胞比例增加，從而影響對癌干細胞行為學的觀察。

本研究屬于尋找舌癌干細胞的前期性和階段性實驗，但是結果很有意義，這12個細胞亞系表明了Tca8113M1細胞系中有存在舌癌干細胞的可能性，而其最初的來源細胞系Tca8113也應存在癌干細胞。結合細胞克隆形態分析的單個癌細胞培養模式可為深入研究舌癌干細胞提供細胞研究平臺。

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關鍵詞： 植物 干細胞 教學應用

干細胞是指具有自我更新能力和增殖分化能力的一類細胞，目前學習者對動物干細胞的理論和應用知識掌握較多。由于植物細胞的全能型，長期以來很多學習者誤認為植物中不存在干細胞，再加上教師對干細胞這部分內容的講授不透徹，造成學習者對植物干細胞、動物干細胞及植物愈傷組織細胞的概念往往混淆不清，存在植物干細胞認知上的錯誤，因此很有必要對植物干細胞的相關知識進行總結。

1.植物干細胞

1.1植物干細胞的概念和特征。植物干細胞是位于植物分生組織中固有的未分化細胞，具有自我更新和再生能力。植物干細胞具有很強的自我更新能力，并且可以分化為特化的細胞類型，這些特化的細胞產生新的植物器官（根、莖、葉和花等）。這些細胞表型的變化是由影響植物功能的基因表達變化引起的，受到內源性和外源性的信號共同調節[1]。植物干細胞的特征包括：能夠形成所有分化細胞的類型；具有自我更新的能力，維持干細胞的數量；位于分生組織。

1.2植物干細胞與動物干細胞的比較。在動物中，通常將干細胞分為胚胎干細胞和成體干細胞。胚胎干細胞具有全能性，它可以分化形成所有的成體組織細胞，甚至發育成為完整的個體；成體干細胞（如造血干細胞、神經干細胞、間充質干細胞、皮膚干細胞等）大多為多能干細胞，它們具有多向分化的潛能，可以分化形成除自身組織細胞外的其他組織細胞，真正具有全能性的細胞是受精卵和其分裂產生的子細胞。與此相比，許多植物干細胞具有旺盛的再生能力，在干細胞的整個生活周期中能使植物生長并且產生新的器官（如植物莖端分生組織中的干細胞和根端分生組織中的干細胞）[2]。

1.3植物干細胞與植物愈傷組織細胞的比較。植物愈傷組織細胞是由成體細胞經過脫分化而形成的具有分化能力的細胞，雖然愈傷組織的分化能力與植物干細胞相似，但它們在來源、細胞分化和增值能力等方面是不同的。植物愈傷組織細胞來源于異質性的體細胞，它是體細胞對損傷的暫時響應，是一個臨時獲得刺激的細胞，盡管愈傷組織具有干細胞樣屬性，但愈傷組織不易維持穩定的細胞分裂[3]。而植物干細胞來源于植物分生組織的同質性細胞，它們在植物的整個生命周期可以產生并形成新的組織和器官。

2.植物干細胞的類別與調控

根據分生組織的種類，植物干細胞可分為莖尖分生組織中的干細胞和根尖分生組織中的干細胞。

2.1莖尖分生組織中的干細胞。莖尖分生組織包括中心區和中心區下方的帶狀區。中心區包括上部干細胞區和下部的組織中心（即干細胞區下部靠近帶狀區的小細胞群）。干細胞分裂時上部的干細胞分裂成兩部分子細胞，一部分干細胞后裔留在中心區并保持多能性；另一部分細胞則離開莖尖分生組織的中心區，但保持較快的分裂速度，最終分化為葉或者花原基器官，為側生器官的生長和分化提供保證[4]。目前已知的位于干細胞周圍“組織中心”的WUS（WUSCHEL）是保持莖尖干細胞特征的必要信號分子，它參與對莖尖干細胞的穩態調控，使整個植物莖尖干細胞保持連續不斷的自我更新和分化。

2.2根尖分生組織中的干細胞。靜止中心位于根尖分生組織中心，干細胞則圍繞在靜止中心細胞周圍。靜止中心作為組織中心維持周圍干細胞的穩定和功能，靜止中心周圍的干細胞分布于中柱鞘外側，維管干細胞形成維管組織、皮層/內皮層干細胞，進而形成皮層、內皮層與根冠干細胞，然后形成根冠細胞。目前已知的WOX5（WUS-RELATED HOMEOBOX 5）作為最主要的干細胞決定因子，特異的表達于根端分生組織的靜止中心，參與對根端干細胞的穩態調控，使整個植物的根尖干細胞保持連續不斷的自我更新和分化[4]。

3.植物干細胞的應用

3.1生產天然產物，開發藥品或者化妝品。傳統的植物細胞培養存在細胞生長緩慢、生產成本高等問題，而植物干細胞培養具有遺傳穩定、細胞生長率和生長模式穩定、凝集程度低等優點，可以用來大量生產有用的植物天然產物，并用于藥品、功能性食品、化妝品中。如懸浮培養紫杉干細胞可以生產松香烷型三環二萜、美麗紅豆杉素A和美麗紅豆杉素B等產物，以達到抑制腫瘤血管的生成和抗癌作用，而且其產值遠大于傳統細胞培養的產值，具有很好的開發前景[5]。

3.2植物細胞系庫的建立和利用。一般的植物細胞凍存后存活率低，恢復生長能力慢，因此限制其在植物細胞培養中的應用。植物干細胞系在低溫儲藏方面有很大的優勢，不僅有高的存活率，而且在低溫儲藏前后遺傳物質沒有變異，是植物細胞系庫建立的很好材料。細胞系庫的建立不僅會使研究材料的供應得到滿足，而且使植物細胞系的研究周期縮短，并在植物種子資源的保存和利用方面發揮重要作用[6]。除了以上應用外，利用植物干細胞還可以進行植物干細胞的分子調控機制和分子設計育種等方面的研究。

4.結語

植物干細胞是位于植物分生組織中固有的未分化細胞，它們具有自我更新和再生能力。根據目前學習者對植物干細胞認識不足的實際，本文對植物干細胞、動物干細胞及植物愈傷組織細胞的概念進行了辨析，并對植物干細胞的分類及應用進行了論述。學習者清楚植物干細胞、植物愈傷組織細胞和動物干細胞的概念后，在學習植物干細胞的理論和應用等方面時才能正確理解相關的知識點。

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放免法檢測胰島素分泌量。結果: 在大鼠β細胞素濃度為20～30 mg/L時， 大鼠胰腺干細胞轉分化為胰島樣細胞團的數量明顯高于對照組; 其胰島素分泌量明顯高于對照組(P

【關鍵詞】 β細胞素; 糖尿病 胰腺干細胞

胰島移植是治療糖尿病的一個熱點， 但供體的缺乏和存在免疫排斥反應限制了其應用。胰腺干細胞能定向分化成胰島細胞， 這為胰島移植提供了新的材料來源［1］。細胞生長因子在干細胞的發育和分化中發揮了重要作用。研究表明， β細胞素（betacellulin， BTC）屬于表皮細

胞生長因子家族中的一個成員， 具有多種生物學功能， 胰腺BTC mRNA的高水平表達， 提示BTC可能在胰腺組織的發育中發揮重要的生理作用［2， 3］。本研究中通過建立穩定的胰腺干細胞體外培養方法， 將β細胞素用于胰腺干細胞的體外培養， 觀察其是否能促進胰腺干細胞轉分化為成熟的胰島， 為克服胰島移植時的供體短缺提供新的胰島來源。

1 材料和方法

1.1 材料

SD大鼠（體質量250 g， 雌雄不限， 飼養于清潔級動物房自由飲水和進食， 手術前1 d禁飲食）由第四軍醫大學動物中心提供， Ⅴ型膠原酶、 Histopaque(1.119 kg/L)、Histopaque(1.098)(kg/L)、 Histopaque(1.077 kg/L)、 堿性成纖維細胞生長因子2(basic fibroblast growth factor 2， bFGF2)、 角朊細胞生長因子(keratinocyte growth factor， KGF)、 ITS(insulintransferin　selenium)購自Sigma公司; 牛血清白蛋白(BSA) 購自杭州四季青生物制品公司; 雙硫腙（dithizone， DTZ）、 二甲基亞砜（DMSO）、 煙堿購

于華美公司; 兔抗小鼠的PDX1和CK19抗體購自北京中山生物工程有限公司; 免疫組化SP檢測試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司; CMRL1066、 DMEM/F12 購于Gibco公司; 胰島素放射免疫分析試劑盒購于北京北方生物技術研究所; 大鼠β細胞素由本研究室采用基因工程方法獲得［4］。

1.2 方法

1.2.1 大鼠胰腺干細胞的分離、 培養

采用宋振順等［5］的方法， 首先以Ⅴ型膠原酶消化成年SD大鼠胰腺組織， 然后采用非連續密度梯度離

心法純化消化后的胰腺細胞， 去除胰島細胞后， 收集外分泌部細胞進行培養。所獲的細胞培養在含100 mL/L胎牛血清的CMRL1066培養液中， 其中添加100 U/mL青霉素、 100 g/L鏈霉素、 500 μg/L二性霉素B。第3天將培養液改為DMEM/F12， 其中加入ITS（5 mU/L胰島素+5 mg/L轉鐵蛋白+5 mg/L硒）500 μg/L二性霉素B， 2 g/L牛血清白蛋白、 10 mmol /L煙堿， 0.01 ng/L KGF等。此后每2～3 d換液1次。于相差顯微鏡下觀察細胞生長狀況和克隆形成情況。

1.2.2 胰腺干細胞免疫組織化學染色

分別取培養3、 7、 14 d后的細胞爬片， 0.4 g/L多聚甲醛(PFA)固定后， PBS緩沖液沖洗玻片， 分別與兔抗小鼠PDX1、 CK19 抗體4℃反應過夜， 二抗及呈色反應參照SP試劑盒說明。二氨基聯苯胺(DAB)顯色， 顯微鏡觀察， 自來水沖洗， 蘇木精復染， 中性樹膠封固。陰性對照用PBS代替一抗。

1.2.3 雙硫腙染色與計數

雙硫腙(DTZ)為螯合劑， 可與鉛、 銅、 鋅等螯合， 人和動物（豚鼠除外）的胰島β細胞因含有鋅， 雙硫腙染色呈猩紅色， 其他胰島細胞不著色。配制及染色方法: 用二甲基亞砜（DMSO）配制: DTZ 10 mg溶于10 mL DMSO， 用Hanks（pH7.8）1∶100稀釋， 0.22 μm濾膜過濾， DTZ與胰腺干細胞培養后轉分化形成的克隆混合， 室溫5～10 min后做鏡檢。按胰島的直徑>50 μm計數染色的胰島樣細胞團，

1.2.4 胰島素檢測

胰腺干細胞轉分化后形成的胰島克隆對葡萄糖刺激有胰島素分泌反應。顯微鏡下挑取100個胰島樣細胞團克隆， 培養于24孔培養板， 先用含低糖（5.5 mmol/L）的DMEM/F12培養液在37℃下孵育1 h后， 更換為含高糖（16.7 mmol/L）加煙堿（10 mmol/L）的DMEM/F12培養液在37℃下孵育2 h后， 取培養液上清， 采用放免法測定胰島素含量。

1.2.5 實驗分組

按照實驗方法1.2.1中胰腺干細胞的培養方法培養大鼠胰腺干細胞， 并將其設為正常對照組， 各實驗組中分別加入不同濃度的大鼠β細胞素， 依次為10、 20、 30、 40、 50 mg/L， 共設立5個實驗組。

1.2.6 統計學處理

采用Student t檢驗方法， 應用SPSS10.0統計軟件完成統計學分析。

2 結果

2.1 成人胰腺導管上皮細胞光鏡下形態學變化

收獲的非胰島細胞于24～48 h內部分黏著于培養瓶底。在第1～3天換液時， 大量漂浮于培養液中的外分泌細胞和胰島被棄除。培養5 d內， 單個貼壁細胞迅速擴增為鵝卵石樣小細胞片進而分裂增殖成單層細胞。培養第3天改用無血清培養液及加入霍亂毒素， 可明顯地促進導管上皮細胞的生長和抑制成纖維細胞的污染。細胞培養第7天胰島樣細胞芽團開始從細胞片或單層細胞的中央或邊緣出現， 同時鵝卵石樣細胞片迅速擴大。此后大量胰島樣細胞芽團和囊狀細胞團出現。雙硫腙染色呈弱陽性。第21～27天， 大量較成熟的胰島樣結構出現，雙硫腙染色強陽性（圖1）。

2.2 免疫組織化學

（1）CK19染色: 細胞培養第1天， 4孔板中的部分細胞呈CK19抗體染色強陽性。此時的細胞多為貼壁的單個或小細胞片， 亦可見較多陰性反應的細胞碎片。培養3 d后， 細胞片不斷擴大， 第7天起， 可見胰島樣細胞芽團出現并逐漸增多， 絕大多數細胞集落和胰島樣細胞芽團均為CK19強陽性（圖2）。（2）PDX1染色: 培養第1天， 4孔玻板中的細胞大部呈PDX1抗體染色陽性。但在同一細胞片中細胞染色程度不一， 部分呈強陽性， 部分呈弱陽性， 少數細胞為陰性。第7天起， 可見胰島樣細胞芽團逐漸增多; 第11～27天， 胰島樣細胞芽團不斷增大， PDX1抗體染色呈強陽性(圖3)。

2.3 BTC對胰腺干細胞轉分化為胰島樣細胞團的影響

在正常對照組中， 胰島克隆為（139±8.5）個/g胰腺， 各實驗組培養液中加入不同濃度的大鼠β細胞素后， 胰島克隆的數量明顯增加， 在大鼠β細胞素的濃度為20～30 mg/L時， 培養液中胰島樣細胞團克隆的數量增加最為明顯

(P

2.4 胰島素分泌量的檢測

各實驗組分別挑取100個胰島樣細胞團（直徑＞50 μm）， 培養于24孔培養板中， 胰島素分泌試驗結果表明， 在正常對照組中， 培養液上清中胰島素含量為（3.0±0.4）μU/100胰島。各實驗組培養液中加入不同濃度的大鼠β細胞素后， 培養液中胰島素的分泌量也有明顯增加， 在大鼠β細胞素的濃度為20～30 mg/L時， 培養液中胰島素的分泌量增加最為明顯(P

3 討論

由于胰島素產生細胞的缺陷或缺乏導致的Ⅰ型糖尿病不僅對患者及其親屬， 而且對社會均帶來了嚴重的負擔。開發胰島素產生細胞新的來源諸如豬的胰腺、 人體胰腺導管上皮細胞、 胎兒胰腺干細胞和胚胎干細胞成為目前研究的熱點。其中最有前景的是由人胰腺導管上皮細胞轉

分化為胰島β細胞。

本實驗觀察到胰腺導管上皮細胞在培養第1天， 絕大多數貼壁生長的細胞為單個細胞或很小的細胞團。這些單個細胞和小細胞片在7 d 內迅速生長擴增為鵝卵石樣細胞片和大面積單層細胞片。胰島樣細胞芽團于培養第7天出現， 部分細胞PDX1 的表達及CK19 染色陽性從培養

第1天即開始。PDX1基因是一種在胰島細胞發育、成熟過程中有高表達的基因， 而CK19是胰腺導管上皮細胞向干細胞轉化的標志， 部分細胞PDX1的表達及CK19 染色陽性說明培養的細胞自第一天起即開始轉分化，這與Gmyr等［6］所報告的結果相似。

近年的研究表明， 一種肽類表皮細胞生長因子β細胞素（BTC）在活體動物體內能有效的促進糖尿病鼠及90%胰腺切除鼠胰島細胞的再生和成熟［7］， 將大鼠胰腺切除90%后， 立即給大鼠尾靜脈注射BTC（0.5 μg/g體質量）， 10 d后大鼠糖尿病狀態有所緩解， BTC治療組大鼠血

糖水平顯著低于對照組， 而血漿胰島素水平明顯高于非治療組， 持續時間長達4周， 治療30 d后病理學檢查證實BTC組大鼠胰島β細胞團較對照組的大， 胰島樣細胞團的數目明顯增多， 糖耐量試驗表明BTC治療的大鼠對糖刺激有很好的反應性［8］; 用鏈脲霉素制成的糖尿病小鼠注射BTC

后， 也取得了同樣的效果［9］， Cho等［10］研究發現， BTC能促進人類胚胎干細胞向胰腺β細胞的分化由此可以推斷， BTC可能促進了β細胞的增殖或者是促進了胰腺干細胞增殖分化為β細胞， 分泌胰島素達到降低血糖的作用。

本研究中我們首先按照宋振順等的胰腺干細胞培養方法培養出大鼠胰腺干細胞， 并對其轉分化為胰島的情況做了初步研究。然后以該培養條件為對照， 在培養液中加入不同濃度的大鼠BTC， 結果發現， 在20～30 mg/L的條件下大鼠β細胞素能有效促進胰腺干細胞的增殖， 促進胰腺干細胞轉分化為胰島樣細胞， 為進一步研究糖尿病疾病的病因， 發病機制， 預防及治療等提供了一定的實驗依據。在本研究中， 當進一步增加β細胞素的劑量后， 胰腺干細胞轉分化為胰島樣細胞團受抑制的原因， 我們認為是由于本實驗室在進行β細胞素的分子克隆中， 我們的蛋白質純化和復性工藝存在局限性， 因此， β細胞素的制劑中可能存在較多的無機鹽或其他雜質， 當增加β細胞素的劑量后， 可能對胰腺干細胞產生毒性作用， 在今后的工作中需要進一步改善蛋白質純化和復性工藝， 提高β細胞素的純度。關于β細胞素在體外促進胰腺干細胞轉分化為胰島樣細胞團的分子機制， 目前尚不明確， 值得進一步研究。

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篇(4)

關鍵詞：天然氣；催化燃燒；細胞；培養

中圖分類號：F407文獻標識碼： A

隨著我國大氣污染的日益嚴重，霧霾天氣區域性頻發，環境問題已變成當前棘手的問題[1]。天然氣催化燃燒能從源頭上防治污染和保護生態環境，有助于形成低投入“低消耗”低排放和高效率的節約型增長方式，有利于對消耗高“污染重”技術落后的工藝和產品實施淘汰，降低污染物排放總量，加強資源綜合利用，加強污染防治[2]。

天然氣屬于清潔能源，天然氣催化燃燒能達到CO和NOx均小于5ppm的近零污染物排放，是一種節能環保的燃燒方式。天然氣燃燒溫度在1000℃以上，燃燒后的煙氣無菌潔凈[3-4]，對環境無污染，可將煙氣與空氣和CO2按照一定比例配比，配比后的氣體達到干細胞所需要的氣體成分，[5-7]，由于高溫煙氣與空氣和CO2混合的，所以混合后的氣體潔凈無菌[4]，可將其經過過濾和降溫通入無菌箱或超凈工作臺使工作區域潔凈無菌，也可將氣體通入到CO2培養箱中，應用到干細胞培養。

1.天然氣催化燃燒煙氣分析

中國計量科學研究院對天然氣催化燃燒煙氣檢測報告結果如表1所示：

表1 天然氣催化燃燒各組分氣體濃度

天然氣催化燃燒，燃料燃燒充分，并且其燃燒溫度在1100攝氏度左右，基本上全部轉為CO2和H2O，CO 和 NOx均小于5ppm，基本為零，由于天然氣中摻加極少量的H2S，燃燒產物為SO2和SO3，但其含量小于5ppm，幾乎為零，所以天然氣催化燃燒效率高，燃燒產物潔凈無菌，可將其用到無菌箱中。

2.干細胞培養所需氣體環境

除了滿足營養的需要以外，培養環境還必須具備細胞生存并繁殖的生理學能接受限度內的物理化學特性，包括溫度、氣相及PH等。

2.1溫度

體外培養的細胞需在保持一定恒溫的環境中才能生長，其適宜的溫度與取材的動物種類有關。

2.2氣相及pH

體外培養細胞需要理想的氣體環境。包括O2及CO2，但其量則須恰當。多數細胞需要在有O2條件下才能生長，氧張力通常維持在略低于大氣狀態，若O2分壓超過大氣中氧的含量可能對有些細胞有害。體外培養細胞采用開放培養時，其氣體環境一般應為5%CO2＋95%空氣的混合氣體。大多數細胞適于在pH7.2~7.4條件下生長，低于pH6.8或高于pH7.6可能對細胞有害，甚至退變或死亡。

3.3 無污染及無毒

體外培養的細胞必須生長于無污染及無毒的環境。無毒是培養細胞的必需條件 [5]。

3. 催化燃燒煙氣在細胞培養上的應用

無菌箱或超凈工作臺是細胞培養中要使用的，催化燃燒煙氣作為潔凈無毒無污染的煙氣可作為無菌氣體持續不斷地通入無菌箱，可使無菌箱持續保持無菌的狀態[4]，燃燒的煙氣與空氣、CO2按照一定比例混合后經過過濾降溫通入無菌箱可以持續的保持無菌箱的無菌狀態，我們將在無菌箱中對細胞操作完之后，將處理后的細胞放入CO2培養箱，傳統形式下需要一個5%的CO2瓶專門向CO2箱通入所需氣體，現在我們只需要將通入無菌箱的氣體通入CO2培養箱即可。

4. 實驗裝置

天然氣催化燃燒V型爐煙氣分析系統如圖1所示，本次實驗采用了兩塊獨石并排的催化燃燒V型燃燒器，所用獨石為堇青石蜂窩陶瓷，獨石內表面上鍍著鈀（Pd）和銠（Rh）催化劑，獨石采用正方形截面尺寸為150mm×150mm，厚度為20mm，獨石孔道尺寸1mm×1mm，壁厚0.18mm，軟化溫度為1380℃。

圖1. 天然氣催化燃燒V型爐系統圖

反應氣體天然氣和空氣分別通過量程為0~50 L/min 型號為GMS005 0BSRN200000的流量計和量程為0~80m3/h 型號為CMG400A080100000的空氣流量計進行調節，這兩個有穩流穩壓器提供電流。在催化燃燒器點火前需要對燃燒器內部的混合腔利用風機進行吹掃5 分鐘左右，來保證內部無殘留的燃氣。點火過程中，先將過量空氣系數調整到1.3左右進行氣相燃燒從而達到預熱的目的，期間觀察催化劑獨石表面待表面火焰基本消失且內部變為紅色時，將空氣量調大使過量空氣系數達到2.0左右，此狀態為催化燃燒的穩定燃燒狀態。此時，通過煙氣分析儀測量排放的煙氣，NO-NO2-NOx分析儀測量煙氣含量，待數據穩定后進行記錄。在箱體出口處插入熱電偶測量煙氣溫度。

5. 實驗結果分析

5.1 實驗結果

我們做了四組實驗分別是燃氣流量為6.1L/min 、7、8、9，相應的空氣流量為7.3m3/h、7.8、9.2、10.3，對應的空氣系數是2.09、1.94、2、2。圖2為記錄的煙氣成分CO、CO2、NOx濃度以及煙氣溫度。

圖2.不同燃氣流量下煙氣各成分濃度圖 3.不同燃氣流量下煙氣溫度

從圖2可以看出，NOx體積分數都在1ppm以下，CO體積分數在5ppm以下，接近于0，污染物含量極低，燃燒效果較好，CO2含量在5.7%上下，略高于細胞培養要求的5%，若將其應用到細胞培養必須改變CO2含量。從圖3可以看出，排煙溫度在300℃以上，接近400℃，與細胞培養要求的37℃相差甚遠，必須降溫。因此需要考慮將煙氣中通入某種氣體或者某幾種氣體將CO2和O2含量調節到細胞培養要求的含量。下面具體分析煙氣的主要成分。

5.2 天然氣組分說明

表 3-2 為通過氣相色譜儀所測得的實驗過程中所使用的天然氣組分及各組分的體積含量。

表1.天然氣各組分體積分數

5.21由于天然氣的主要成分是甲烷，所以天然氣燃燒的化學反應方程式如下[8]：

實驗用到的天然氣中甲烷占燃料總體積的 93%以上，所以實驗中是以甲烷的不完全燃燒情況進行了計算。所有含碳燃料在燃燒過程中都會產生CO這一中間產物。根據上述反應方程式可知，反應前后C原子個數是守恒的，反應后CO和CO2的總體積與反應前CH4的體積相等，即 。因為含量微乎其微，可以忽略不計，所以可以認為和燃燒前的含量相等，即；產生水蒸氣的量為，需要氧氣量，需要空氣量

煙氣總體積:

5.22 過量空氣系數為時，過量空氣相當于多出未參加燃料反應的那部分空氣產生的和水蒸氣的量不變，即，

過量空氣相當于多出未參加燃料反應的那部分空氣，煙氣中氧氣的體積:

煙氣的總體積：

干煙氣的總體積：

二氧化碳的體積分數:

氧氣的體積分數:

干煙氣中二氧化碳的體積分數:

氧氣的體積分數:

催化燃燒空氣的空氣系數是2，當過量空氣系數為2時，帶入上式

二氧化碳體積分數（煙氣中有水蒸氣）:

氧氣體積分數（煙氣中有水蒸氣）:

二氧化碳體積分數（煙氣中沒有水蒸氣）:

氧氣體積分數（煙氣中沒有水蒸氣）:

5.23 煙氣分析儀使用塑料管將氣體通入分析儀分析煙氣成分，在管道中煙氣降溫到室溫，水蒸氣冷凝，所以可以近似認為煙氣分析儀分析的氣體為干煙氣，數據計算CO2含量5.5%與實驗相當接近。

由于需要將煙氣中通氣體，雖然向濕煙氣中通氣體調節，但通入細胞培養儀器時的溫度為37℃，中間水蒸氣還會冷凝，所以調節氣體的體積分數時仍然需要按照干煙氣的計算調節。

對比煙氣成分含量與要求的成分含量可以看出，需要降低CO2含量，提高氧氣含量。因為氧氣提高到略低于21%所以可以通入空氣，即能提高O2含量又能降低CO2。假定煙氣總體積為V，通入空氣體積為Vx，則CO2體積為5.541，O2為11.082。

通過計算通入空氣后CO2含量會低于要求的含量，因此還需通入CO2，通入CO2體積為VY

將，，，

解得，

當煙氣的體積為V（不含水蒸氣）時，通入的燃氣量為0.0554V，空氣量為1.0554V，所以只要通入體積，燃氣量：空氣量：CO2量=0.0554:155；0.0523=1:2797:0.944時，輸出的煙氣的成分即為，。

6. 結論

天然氣屬于清潔能源，天然氣催化燃燒煙氣潔凈無菌，將燃燒廢氣收集重新利用通入CO2培養箱進行干細胞培養，此種方法使用即可以將煙氣充分利用，減少CO2排放，并且操作簡單，只需要向燃燒完的高溫煙氣中通入定量的空氣和CO2即可，而且從通入氣體的比例來看，生成需要的氣體向煙氣中通入的空氣很多，通入的CO2確很少，比較經濟，因此天然氣催化燃燒煙氣應用到細胞培養是種經濟環保的方式。

致謝

本資金由北京市供熱供燃氣通風及空調工程重點實驗室提供，項目編號cxy2012019。

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篇(5)

據英國媒體報道，英國研究人員首次用3D打印機打印出胚胎干細胞，干細胞鮮活且保有發展為其他類型細胞的能力。我們知道，胚胎干細胞存在于胚胎發育早期的囊胚中，可發育為不同的細胞，是所有細胞最初期的形態。胚胎干細胞是萬能的，意味著它們可以發育成為身體內200多種細胞類型中的任何一種。研究人員說，這種技術或可制造人體組織以測試藥物，制造器官，乃至直接在人體內打印細胞。

胚胎干細胞3D打印機配備兩個“生物墨盒”，一個裝著浸在細胞培養基中的人體胚胎干細胞，另一個只有培養基。計算機控制微調閥噴出“墨水”，其速度可通過改變噴口直徑實現精確控制。

打印機上有顯微鏡，可以觀察細胞打印情況。兩種“墨水”一層一層間隔噴灑，形成不同濃度細胞飛沫，最小飛沫體積僅2納升，包含大約5個細胞。飛沫被噴入有諸多凹孔的培養皿中，翻轉培養皿，飛沫形成懸液，在各凹孔內“抱成團”。打印機可精確控制飛沫大小，使干細胞達到分化的最佳狀態。

研究人員在《生物制造》雜志說，檢測結果顯示，打印24小時后，95%以上細胞仍然存活，打印過程未殺死細胞；打印3天后，超過89%細胞存活，而且仍然維持多能性，即分化出多種細胞組織的潛能。

研究人員已經用3D打印的干細胞制造出骨髓和皮膚。他們認為，最終能借助這種方法制造器官，從而無需器官捐獻，同時還可以解決器官移植中的免疫抑制等問題。

篇(6)

[關鍵詞]毛囊干細胞；鑒定；分離培養

[中圖分類號]R329.2 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2015）19-0077-04

The cultivation and identification of hair follicle stem cells

XIAO Feng1，TAN Jun2

（Department of Plastic and Laser Aesthetic Surgery，People's Hospital of Hunan Province，Changsha 410000，Hunan，China）

Abstract： Hair follicle stem cells are the ideal seed cells for skin tissue engineering，which has become a hot research topic in recent years.Isolation and identification is the basis of the research. The author will analyze and summarize several methods of isolation and culture of hair follicle stem cells in recent years.It will provide a solid foundation for the further study of hair follicle stem cells.

Key words：hair follicle stem cells；identification；cultivation

干細胞是一類具有自我復制能力的多潛能細胞，存在于胚胎及成體內。在一定條件下，干細胞可以無限增殖而保持未分化狀態，也可以分化成多種功能細胞。20世紀，Cotsarelis、Taylor等[1]通過相關研究發現，在毛囊上部由外根鞘形成的明顯突起，即隆突區域也有干細胞的存在，這些干細胞被定義為毛囊干細胞。毛囊干細胞與其他成體干細胞一樣擁有強大的增殖能力及多向分化潛能[2]。毛囊干細胞能通過自身的分裂增殖產生各種機體所需的細胞，以補充脫落和缺失的細胞；毛囊干細胞不僅能夠向下轉移到毛囊根部生成毛囊，而且還能從毛囊外根鞘向上遷移，生成表皮和皮脂腺，并且能分化形成骨及脂肪[3-4]。近年來，毛囊干細胞的研究備受關注，已成為研究熱點之一。目前，存在多種毛囊干細胞的分離培養及鑒定方法，為毛囊干細胞的深入研究提供了堅實的基礎，作者就毛囊干細胞常用的分離培養及鑒定作一簡要綜述。

1 毛囊干細胞的分離純化

此前，已有許多研究者采用不同的方法來分離毛囊干細胞，并成功地進行傳代培養，進行后續更深入的研究。目前對毛囊干細胞分離純化常用的有以下幾種方法：

1.1 組織塊培養法

取含有毛囊的皮膚樣本，清潔干凈，酒精消毒后用PBS液沖洗，將皮膚切成小塊，表皮朝上貼于加入適量培養基的培養器皿中，置于5%CO2培養箱中，37℃，飽和濕度條件下培養。組織塊培養法分離的干細胞能持續保持增殖趨勢，沒有明顯的平臺期，并且隨著不斷傳代純化，此方法獲得的毛囊干細胞純度明顯增加。但是組織塊培養法分離獲取毛囊干細胞的效率較低。史明艷等[5]使用該方法成功獲得毛囊干細胞，并分析指出該方法的優勢在于組織塊培養時從組織塊中遷移出來其他細胞為毛囊干細胞創造了一個類似于體內的微環境，使毛囊干細胞能最大程度地保留增殖分化能力。

1.2 顯微分離技術

取含有毛囊的皮膚樣本，清潔干凈，除去皮下脂肪，酒精消毒后，使用含高濃度青、鏈霉素的PBS液反復沖洗3次；在超凈工作臺內，顯微鏡下顯微鑷鈍性分離單個毛囊組織，收集形態完好且處于生長期的毛囊。收集濾液離心（1 500r/min）10min，棄去上清，加入含培養基培養皿，于37℃、5%CO2孵箱中培養。顯微分離技術能從樣本直接選取毛囊干細胞相對富集區域，有利于后續進一步的純化[6]。王祝遷等[7]使用此方法成功分離出大鼠毛囊干細胞，但單純應用顯微分離技術獲取高純度的毛囊干細胞需花費大量的時間和精力，效率偏低。

1.3 酶消化法

取含有待培養毛囊的皮膚樣本，清潔干凈，酒精消毒后用含雙抗PBS液沖洗，將皮膚樣本剪成小塊，置于中性蛋白酶Ⅱ（0.25g/l）中，37℃搖床消化2h。取出組織用PBS沖洗3遍，置于胰蛋白酶（質量濃度為2.5g/l）和乙二胺四乙酸（0.2g/l）1∶1消化液37℃搖床消化1h后，過200目鋼網。收集濾液離心（1 500r/min）10min，棄去上清，加入細胞培養液培養。此方法獲得的毛囊干細胞克隆形成能力強，獲取效率高。鄭宣等[8]用此法獲得較純的毛囊干細胞，但獲得的毛囊干細胞經歷增殖期后生長速度逐漸減慢，且細胞存活率下降，可能與酶消化法破壞了毛囊干細胞生長微環境有關。

1.4 差數貼壁法

將收集的細胞接種于Ⅳ型膠原包被的培養皿中，靜置20min后，收集上層未貼附角質形成細胞和毛囊真皮成纖維細胞于另一培養皿中，貼附皿底的毛囊干細胞，置于體積分數為5%CO2、37℃孵箱中培養，每3d換液一次。與單純使用某種毛囊干細胞分離方法相比較，聯合差數貼壁法將更進一步純化，獲得純度更高的毛囊干細胞。彭等[9]使用酶消化法聯合差數貼壁法獲得了形態典型且均勻一致的毛囊干細胞。目前此方法已被廣泛使用。

1.5 免疫磁珠法

免疫磁珠法主要用來純化分離培養獲得的毛囊隆突區細胞中某種標記物陽性的細胞。首先制作細胞懸液，并加入FITC標記的某種標記物單抗，室溫孵育30min，離心后棄上清中未結合的抗體，加入磁珠分選緩沖液重懸細胞，再次離心后棄上清，PBS緩沖液清洗2次，取重懸后細胞與免疫磁珠混合，室溫反應30min。磁珠分離器分離8min，去除未與磁珠結合的細胞。將結合了靶細胞的免疫磁珠用磁珠分選緩沖液洗5次。體積分數為5%CO2、37℃孵箱培養48h，使細胞與磁珠分離，即可獲得較純的毛囊干細胞。譚挺等[10]用此法獲得高純度毛囊干細胞，他們指出此方法與顯微分離技術連用有單次操作分離細胞數量大且純度較高、能與細胞培養、流式細胞術、熒光顯微鏡等分子生物學技術兼容等特點。黃恩毅等[11]用此法有效分離并成功培養CD34+毛囊干細胞，發現分選后的細胞仍具有較好的活性，且增殖速度快，增殖期長。盧葳等[6]通過實驗證實，免疫磁珠分選后毛囊干細胞活力較好，分離獲得的毛囊干細胞適合用于細胞培養、誘導等后續試驗。

1.6 流式細胞儀分選法

通過毛囊干細胞表達的某些特異性標記物，利用流式細胞儀可以將目的活細胞從異質性細胞群中分離出來，獲得較高純度的特異性細胞。常用的是熒光激活細胞分選器。盧葳等[6]使用流式細胞儀分選CD34+毛囊干細胞，獲得的毛囊干細胞純度很高、污染機會小，但是分選過程費時，細胞分選后活力稍差。此方法適合于需要做免疫組化，蛋白質組織學等對細胞純度要求高的實驗。

2 毛囊干細胞的鑒定

干細胞的鑒定一直是干細胞研究的難點，常用干細胞的標記物輔助方法進行鑒定。毛囊干細胞有多種明確的分子標記物，如CD34、K15、K19 [12]。

2.1 角蛋白家族

角蛋白是外胚層細胞的結構蛋白，廣泛存在于生物體的組織結構中。在表皮細胞中，它們以微絲的狀態在細胞內形成廣泛的網狀結構。在上皮組織中有20多種不同種類的角蛋白表達。在表皮細胞中，隨著分化程度的不同其所表達的角蛋白也不相同，因此角蛋白常作為毛囊干細胞的鑒定手段。1998年，lyle等[13]通過表達克隆發現K15是毛囊干細胞表面標記之一，此后K15一直被當做較為公認的毛囊干細胞標記物。20世紀末，有研究者通過實驗發現滯留細胞所在的毛囊隆突部細強表達K19[14]；同時有實驗發現毛囊隆突部K19高表達細胞缺乏特異性分化標志，進一步證實 K19高表達細胞為毛囊干細胞，因此，認為K19也可作為毛囊干細胞表面標記物[15]。在毛囊干細胞分化過程中，K15表達減弱較K19早，K19表達陽性而K15陰性的細胞仍有可能為處于早期階段的增殖細胞，因此推測，檢測毛囊干細胞時K15更準確[13]。

2.2 鈣黏蛋白家族

鈣黏蛋白是一種同親型結合、Ca2+依賴的細胞黏著糖蛋白，對胚胎發育中的細胞識別、遷移和組織分化以及成體組織器官構成具有重要作用。不同細胞及發育不同階段其細胞表面的鈣黏蛋白的種類與數量均有所不同，目前已經發現幾十種鈣黏蛋白。CD34抗原是鈣黏蛋白中的一種，是一種高度糖基化Ⅰ型跨膜蛋白，為階段特異性白細胞分化抗原，CD34表達于人類造血干細胞，CD34是目前公認的造血干細胞標志物。Ohyama等[16]通過對鼠毛囊的研究，發現鼠毛囊中CD34陽性細胞與毛囊隆突部滯留細胞和K15陽性細胞在毛囊處位置一致，提示CD34可能也是可靠的毛囊干細胞標記物。Trempus等[17]通過動物實驗首次證實了CD34表達于小鼠毛囊干細胞。但CD34在人毛囊干細胞不表達，Shu Jiang等[18] 通過對人頭皮進行原位免疫組化和多色免疫熒光標記，發現CD34特異性表達于毛囊間表皮基底部。

2.3 整合素家族

整合素是機體重要的黏附分子，是廣泛存在于動植物細胞表面的一類細胞跨膜蛋白，在細胞與細胞外基質間及細胞與細胞間起黏附作用，整合素是由α和β兩個亞單位組成的異源二聚體，它們按不同的組合構成20余種整合素。目前，整合素也被廣泛用于毛囊干細胞的鑒定，常用的整合素為整合素β1。1995年，Jones等[19]根據表皮細胞表達整合素β1的水平將其進行分組培養，結果發現整合素β1高表達的表皮細胞比低表達者具有更高的增殖及克隆形成能力。1998年，Watt等[20]發現，富含整合素β1的皮膚基底細胞比整合素β1含量少的皮膚基底細胞能更快速的黏附細胞外基質蛋白，并具有更高的克隆形成能力，上述發現均為整合素β1作為毛囊干細胞特異性表面標記物提供有力支持。

3 結論

綜上，目前常用的分離培養方法主要包括：組織塊培養法、顯微分離技術、酶消化法、差數貼壁法、免疫磁珠法、流式細胞儀分選法，每種方法均有各自的優勢及缺陷；組織塊培養法簡單，但是分離純度不高，分離效率低下；顯微分離技術相對其他方法而言，分離純度高，但是分離過程比較費時費力；酶消化法效率高，但是酶消化過程同時會破壞細胞微環境，影響細胞存活率；差數貼壁法一般聯合其他分離純化方法，能進一步純化所獲毛囊干細胞；免疫磁珠法獲得的毛囊干細胞純度高、活性強，但是分離方法較復雜；流式細胞儀分選法所獲得毛囊干細胞純度高，但細胞活性低。因此，在選擇毛囊干細胞分離培養方法時一定要根據實驗的特殊要求及實驗條件選擇合適的方法。毛囊干細胞的鑒定方法常用的包括：角蛋白家族、鈣黏蛋白家族、整合素家族；實驗條件允許的情況下，同時檢測兩種以上的標記物來鑒定毛囊干細胞是較為準確的一種方法。

毛囊干細胞具有其他干細胞的共同特征，具有多向分化潛能。目前，已有實驗證實毛囊干細胞能用于尿道缺損、神經損傷的修復；能夠分化成為脂肪細胞和成骨細胞[1，21-22]；能有效促進創面愈合，將其作為工程皮膚中的種子細胞，有利于表皮細胞及汗腺、毛囊等附屬器官的形成。另外，最新研究表明毛囊干細胞有利于瘢痕的修復，但該研究仍處于起步階段，相信經過研究者們的不懈努力，其必將為瘢痕治療這一世界性難題提供一種有效的新方法。

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篇(7)

目的： 利用簡化無血清培養基和連續傳代法，從成體小鼠腸管分離培養腸神經嵴干細胞(GNCSCs)，觀察細胞體外培養過程中增殖、分化的特點. 用p75， GFAP，Peripherin，αActin作為特異性標志來鑒定GNCSCs及其分化的細胞系. 方法： 將新生1， 5 d的小鼠腸管制成單細胞懸液，接種于無血清DMEM/F12完全培養基中貼壁培養，連續傳代培養并觀察克隆球的形成過程. 將克隆球接種于含血清的DMEM/F12完全培養基中，觀察其分化現象. 用免疫細胞化學和免疫熒光法檢測克隆球及其分化細胞系特異性標志物的表達. 結果： 成體小鼠腸管中有少數細胞在無血清培養基中存活且增殖形成克隆球. 免疫染色表明克隆球是GNCSCs并且在血清誘導下可分化為神經元、神經膠質細胞、平滑肌細胞. 結論： 成體腸管中存在具有自我更新和多向分化能力的GNCSCs，在體外GNCSCs可分化為腸神經系統所必須的細胞類型.

【關鍵詞】 腸神經嵴干細胞 小鼠 細胞培養技術 細胞分化 Hirschsprung病

0引言

應用神經干細胞治療某些神經系統的損傷和退行性疾病，經過較長時間的實踐已被證明是行之有效的［1］. 腸神經嵴干細胞（gut neural crest stem cells， GNCSCs）起源于神經管背側，具有干細胞特性［2］，將其用于治療先天性巨結腸癥及腸神經系統干細胞疾病的研究已引起人們的關注，本實驗著重進行GNCSCs的基礎研究，為臨床應用建立理論基礎.

1材料和方法

1.1材料新生1，5 d昆明小白鼠，15只，體質量不拘，西安交通大學醫學實驗動物中心提供. ① DMEM/F12完全培養基（Gibco）組成：B27添加劑（Gibco），N2添加劑（Gibco），重組人堿性成纖維細胞生長因子(bFGF， vitrogen)， β巰基乙醇（Sigma），青霉素和鏈霉素（華北制藥）. ② 促分化培養基組成：DMEM/F12完全培養基除bFGF外再添加100 mL/L肽牛血清. ③ 其他：胰蛋白酶、Ⅳ膠原酶（Sigma），左旋多聚賴氨酸（Sigma）. 一抗：兔抗小鼠NGFRp75（武漢博士德）、兔抗Peripherin多克隆抗體(Chemicon)，兔抗GFAP多克隆抗體（DAKO），鼠抗小鼠αActin單克隆抗體（Sigma）SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒（博士得生物工程有限公司）. 二抗為TRITC標記山羊抗小鼠IgG(北京中杉).

1.2方法

1.2.1取材、克隆球的培養頸椎脫臼法處死2組小鼠，將其腸管放入Hanks，清洗，機械分散腸管組織，胰蛋白酶和Ⅳ膠原酶分別消化腸管組織30 min，10 min，終止消化后反復吹打制成單細胞懸液，用200目，400目的濾網過濾，以800 r/min 離心 5 min，棄上清，用預先配置的無血清完全培養基重懸細胞，臺盼藍染色計數活細胞，以 6×108個/L接種到25 mL培養瓶中，添加培養基至4 mL. 在37 ℃， 50 mL/ L CO2，飽和濕度培養箱中水平放置，貼壁培養. 原代孵育24 h后棄去漂浮的死細胞，以2/3量換液，孵育3 d后進行傳代，以6×108個/L接種到25 mL培養瓶中，繼續孵育40~48 h后再次傳代，如有細胞團塊形成則以1代/1~2 d的速度傳代，3代之后可形成圓形的克隆球.

1.2.2克隆球的分化用含100 mL/L胎牛血清的完全培養基重懸傳代5次后的克隆球，接種于放置有預先包被左旋多聚賴氨酸蓋玻片的35 mm培養皿內，每皿2 mL，動態觀察克隆球的分化情況.

1.2.3克隆球及其分化細胞特異性標志物的染色應用p75NTR， GFAP， Peripherin，αActin抗體分別檢測克隆球及其分化細胞系的性質，封片后分別用光學顯微鏡和激光共焦顯微鏡取圖.

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2結果

2.1克隆球的生長狀況接種初期，倒置顯微鏡下觀察到單細胞和一些呈半球狀或不規則的細胞團. 孵育24 h后，貼壁細胞胞呈圓形，胞體小，折光性好，部分貼壁細胞胞體增大，折光性增強，出現分裂相，形成2～5個細胞的細胞團，另一部分呈聚集生長. 3 d后形成十幾或數十個細胞構成的克隆球(圖1A)，克隆球增大的同時向周圍伸出放射狀的細胞索，形成較小的次級克隆，這些克隆球形態完整，折光性減弱，周邊界線清晰，但其中心密集，界限不清，無法觀察到完整的細胞結構 （圖1B）. 重新傳代培養，可觀察到細胞胞體增大，出現分裂相的克隆球數量逐漸增多，雜質細胞減少，在連續傳代過程中克隆球逐漸純化.

2.2克隆球的分化接種含血清培養基12 h后，可見有細胞從克隆球中遷出，遷出的細胞貼壁生長；24 h后克隆球變扁，遷移出的細胞增多，相差顯微鏡下難以分別形態；48 h后貼壁細胞數量明顯增加，逐漸形成單細胞層且細胞形態多元化.

2.3克隆球及其分化細胞系的免疫染色免疫細胞化學方法進行p75， Peripherin， GFAP， αActin免疫染色（圖1C，圖2， 3）.

3討論

許多研究表明GNCSCs在ENS的發生和發育起關鍵作用［3-4］. 目前HSCR的病因與RET等8種基因密切相關［4-5］，在RET等基因缺失模型中， GNCSCs的生存、增殖、遷徙及分化等功能發生障礙，受累腸道的相應神經節出現缺失，表明先天性巨結腸可能是一種干細胞疾病. 由于HSCR及腸神經系統干細胞性疾病在手術治療后仍遺留有嚴重的并發癥，因此用干細胞來進行臨床治療已成為研究的熱點和重點. 鑒于胚胎干細胞的來源限制及免疫排斥問題，成體GNCSCs的研究將為今后的移植試驗提供新契機.

GNCSCs的培養方法建立在中樞神經干細胞的基礎上. 依據神經干細胞經典的培養方法，再結合GNCSCs“收獲率”低、難以分離純化的特點，聯合應用簡化的特殊培養劑和神經干細胞培養方法進行體外培養. 連續傳10代后，GNCSCs的相對比例明顯增加，這種體外培養的方法能有效地分離和純化GNCSCs，但并不能完全消除其他細胞. 如果繼續傳代，其純化程度越高，后續的試驗效果將更佳. 連續傳代不僅純化了GNCSCs，還證實了干細胞的自我更新特性. 在體外培養干細胞時，培養條件稍有變化可導致分化機制的啟動，因此采用血清促分化法誘導GNCSCs分化既簡單又可靠. 通過免疫染色，證實了GNCSCs分化細胞的類型，同時顯示了分化的亞型神經元及神經膠質細胞的形態，并表明了成體干細胞的多向分化能力.

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